氮離子注入選育高自溶干酪乳桿菌及其肽聚糖水解酶的RT-qPCR分析

崔文明，呂加平，王小鵬，趙莉君，祝超智，張秋會，李苗云，趙改名

1(河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州，450002) 2(農業部農產品加工與質量控制重點開放實驗室,中國農業科學院 農產品加工研究所,北京，100193)

干酪乳桿菌是干酪制品生產中常用乳酸菌發酵劑的重要組成部分。在干酪成熟過程中，風味形成不僅需要分泌到胞外的蛋白酶，同時也需要胞內的脂肪酶和肽酶，而正是乳酸菌自溶過程中釋放的肽酶和脂肪酶將牛乳中的脂肪、蛋白和肽水解為風味物質，才賦予其獨特的風味和優良的品質[1-3]。發酵劑的自溶會導致蛋白水解物的增加，尤其是游離氨基酸的增加(在干酪成熟過程中可以增加2～3倍)，苦味降低，從而使干酪產生更好的風味[4-6]。除了賦予干酪制品獨特的風味外，發酵劑自溶的適當提高可以加速干酪的成熟，縮短干酪成熟的生產周期，當自溶菌株與非自溶菌株聯合使用時，可以有效地縮短切達干酪的成熟時間[7-8]。

低能量離子注入作為一種較新的人工誘變技術，與其他傳統誘變方式(如γ射線、紫外照射等)相比具有損傷率低、突變率高和突變域廣的優點，被廣泛應用于植物[9-10]、微生物[11-12]育種領域。常用的離子束有He+，Ar+，N+，所用能量一般在數十至數百keV，原理主要為經過質量選擇和加速的低能量離子束在真空條件下被注入生物體細胞時，離子束本身的能量可以直接造成胞內重要的生物大分子如蛋白質被分解，雙鏈DNA的解鏈，單鏈DNA和堿基的損傷[13]。目前用于誘變的低能量離子束的能量要比傳統的離子能量束能量至少低3個數量級，最初主要應用于干的植物種子的誘變，在微生物體系中的應用則因高水分含量限制了低能量離子束的發射范圍，使得離子能量不能有效到達生物樣品的內部并產生預期的生物效果[14]。此后，隨著研究人員對低能量離子注入與生物體間的相互作用關系，從能量發射與吸收、質量堆積效應和電荷積累和轉移等方面進行了深入的研究，最終確定了目前可用于微生物誘變的低能量離子誘變技術，并使其在工業應用微生物的育種篩選方面得到廣泛應用[15]。

本研究中，通過不同能量的低能N+注入的方式誘變干酪乳桿菌116-a，以自溶度為考察指標，篩選高自溶突變菌株，并通過掃描電鏡觀察突變前后自溶菌體的形態變化，然后利用熒光定量PCR來檢測高自溶突變菌株與野生菌株間N-乙酰胞壁質酶(AcmA)和N-乙酰氨基葡糖胺糖苷酶(GlcNAcase)的表達差異，從而確定在干酪乳桿菌116-a自溶中起關鍵調控作用的肽聚糖水解酶。

1 材料和方法

1.1 材料與主要儀器

干酪乳桿菌 116-a于-20 ℃保存；MRS肉湯培養基和MRS(北京陸橋技術有限責任公司)；細菌gDNA提取試劑盒、100 mg/mL RNase A溶液、20 mg/mL溶菌酶、RNAPrep Pure細菌總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；2×Bench TopTMTaqMaster Mix與瓊脂糖凝膠/PCR產物純化試劑盒(美國Biomiga公司)；Biowest常規瓊脂糖G-10(香港Gene company Limited)；甘氨酸(超純級)；Goldview核酸染料(北京拜爾迪生物技術有限公司)；Triton X-100(分析純，國藥化學試劑有限公司)；反轉錄試劑盒(美國 Promega公司)；SYBR Green Ⅰ試劑、Prism 光學反應管(美國 ABI公司)；DEPC(美國Amresco公司)。

DU800核酸蛋白分析儀，美國Backman；SIGMA 3K-15臺式高速冷凍離心機，Sigma公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；UV2300分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；DL-CJ-IN高性能無菌試驗臺，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；Alpha Ease FC凝膠成像分析系統，美國Alpha Innotech；雙穩定時電泳儀DYY-6C，北京六一儀器廠；TP600梯度PCR儀，日本TAKARA；DHP-9082電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；AUW220電子分析天平，日本Shimadzu公司；WH-3微型旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ABI 7500熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems；400 keV離子注入機，北京師范大學低能核物理研究所；Delta 320 pH計，法國梅特勒。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株保藏及培養基制備

將貯藏于-20 ℃冰箱的凍干菌粉，在37 ℃條件下采用MRS肉湯培養基活化3次以上，短期內可儲存于4 ℃冰箱備用。MRS肉湯培養基依照產品說明書標示比例進行配制，滅菌條件：115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 樣品制備和N+注入

將活化后的干酪乳桿菌116-a培養至對數生長期后，以4%(體積分數)接種量接入MRS肉湯培養基于37 ℃恒溫培養箱中培養至OD600nm=1.5左右，使用無菌MRS肉湯培養基稀釋菌懸液細胞量為2×108CFU/mL左右。

在超凈工作臺中添加100 μL上述菌懸液于直徑9.0 cm的潔凈無菌培養平皿中，涂布棒涂布均勻后，無菌風吹干形成菌膜，光學顯微鏡鏡檢無細胞重疊后，進行離子注入。取原種子菌懸液經稀釋后，計算活菌落數。

采用注入能量30 keV的N+源，離子注入劑量分別為0.5×1015、1.0×1015、1.5×1015、2.0×1015、2.5×1015、3.0 ×1015ions/cm2。設置未進行離子注入操作的真空對照和空氣對照。離子注入后，立即采用無菌MRS培養基進行沖洗，將上述沖洗液經適當稀釋后取100 μL均勻涂布于MRS瓊脂培養基上，37 ℃培養48 h，記錄稀釋度與其對應的平板菌落數，按公式(1)計算存活率。

(1)

1.2.3 突變菌株的篩選

分別挑取N+注入后的單菌落于MRS肉湯培養中培養至OD600nm值為0.8～1.0，然后離心(12 000 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體檢測自溶度。

突變率：以菌體自溶度變化作為考察指標，以原始菌株為空白參照，當突變菌株自溶度的變化幅度不超過±10%時定義為無意義突變，當突變菌株自溶度變化低于-10%為負突變株，高于10%為正突變株。正突變率，負突變率和總突變率按公式(2)、(3)、(4)進行計算：

(2)

(3)

(4)

1.2.4 自溶度的檢測

經活化的實驗菌株培養至對數生長期后，以4%的接種量接種于MRS肉湯培養基，37 ℃下培養至目標菌體濃度后,離心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)收集菌體。無菌生理鹽水懸浮洗滌菌體，重復洗滌3次，無菌備用Tri-HCl緩沖液(50 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA)洗滌菌體1次，懸浮收集菌體于pH 6.5的Tri-HCl緩沖液，至菌懸液(OD600 nm值為0.4～0.6)，測定初始OD600 nm，讀數記為A0。其余上述菌懸液置于37 ℃培養箱溫育24 h后，測定OD600 nm，讀數記為A24h。則菌體自溶度按公式(5)計算求得：

(5)

1.2.5 實時熒光定量PCR引物設計及合成

分別以干酪乳桿菌BL-23基因組為模板，以 Primer premier 5.0軟件設計N-乙酰氨基葡糖胺糖苷酶，N-乙酰胞壁質酶和內參基因16S核糖體DNA的引物，并采用NCBI-Primer blast對引物特異性進行檢驗。采用mfold 在線軟件(http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Quickfold)對引物擴增子的二級結構進行預測。所設計引物序列(表1)送至北京華大基因進行合成，合成引物于-20 ℃保存備用。

1.2.6 細菌總RNA的提取及cDNA的合成

總RNA的提取參考試劑盒中操作說明。

cDNA合成：參照反轉試劑盒用戶手冊。具體反轉體系為：25 mmol/L MaCl24 μL;Reverse Transcription 10 ×buffer 2 μL;10 mmol/L dNTP Mix 2 μL;rRNasin RNase inhibitor 0.5 μL;AMV Reverse transcriptase 15 U;Random primers 0.5 μg,總RNA template 1 μg,添加無核酸酶水(nuclease-free water)至總反應體積20 μL。反應條件為：室溫下放置 10 min，42 ℃反應60 min，95 ℃，5min滅活反轉錄酶活性，0～5 ℃放置5 min，于-20 ℃保存備用。

1.2.7 實時熒光定量PCR

PCR 反應體系如下:總反應體積為20 μL，10 μL 2×PCR mix (含SYBR-Green I)，4 μL cDNA模板，10 μmol/L 上下游引物各 2 μL和2 μL無核酸酶雙蒸水。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30s，72 ℃，1 min (40個循環)；72 ℃ 延伸10 min。在延伸階段檢測熒光強度,收集信號。分別對引物進行融解曲線的分析:加熱樣品從60 ℃ 到95 ℃,每隔0.5 ℃ 停留1 s 檢測1 次熒光強度變化。設置無模板空白對照(雙蒸水為模板)和RT-陰性對照(以RNA為模板)。

1.2.8 掃描電鏡觀察

分別低速離心收獲處于對數生長期的高自溶突變菌株菌體細胞和野生型菌株細胞，生理鹽水洗滌3次，TE緩沖液洗滌1次后，重懸于TE緩沖液，置于37 ℃培養箱孵育24 h,離心收集菌體，重懸于電鏡樣品固定液，備用。將高自溶突變菌株自溶細胞和野生型菌株自溶細胞經臨界點干燥后，樣品放置于SEM盤，表面噴金后放置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.9 數據處理與分析

應用Statistics Analysis System(SAS)9.2進行單因素方差分析，P<0.05視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 N+注入干酪乳桿菌116-a的存活率

離子注入的能量和劑量決定著突變菌株的存活率和突變率。如圖1所示，N+注入會顯著降低菌體的存活率，相比對照組，經過N+注入之后，菌株存活率均在32%以下。但菌體存活率并不隨著注入劑量的增大而降低，而是在不同的N+注入劑量下表現出典型的“馬鞍型”特征，使其顯著區別于紫外、X射線和γ射線。

N+注入之所以能夠造成菌體的大幅度死亡是因為當離子注入細胞時會由于離子刻蝕效果在細胞表面產生類囊泡結構和孔洞，甚至破壞細胞壁的完整性，此外離子注入所引入的能量和電荷的積累則會損傷菌體細胞內的核酸結構和大分子活性物質[16]。而“馬鞍型”劑量效應曲線的可能產生機制是低劑量離子注入時以離子的動量轉移效應和能量沉積效應為主，兩者的共同作用則會極大地損傷細胞內的核酸和生物膜，最終導致菌體的死亡；當注入劑量逐漸提高至某一閾值時，細胞自身的修復機制會被激活從而產生系列修復行為以維持菌體的存活，此時在細胞表面堆積的電荷產生的庫倫斥力也在一定程度上阻礙了后續離子對細胞造成的損傷；當注入劑量繼續增大時，細胞自身的修復速度將遠遠低于細胞損傷的速度而電荷積累效應到達臨界點時也會產生庫倫爆炸，此時保護屏障被破壞而自我修復能力的不足，則導致細胞存活率再度降低[17]。

2.2 干酪乳桿菌116-a突變株的篩選

2.2.1 N+注入干酪乳桿菌116-a的突變率

如圖2所示，在0.5×1015～2.5×1015ions/cm2之間，隨著注入劑量的增加菌株突變率也隨之增加。注入劑量在0.5×1015～3.0×1015ions/cm2之間時，最大正突變率和負突變率分別在注入劑量2.5×1015ions/cm2和2.0×1015ions/cm2處。而最大注入劑量時則導致最低的菌株突變率，可能是由于存活率的降低導致了突變率的降低。而在注入劑量1.5×1015ions/cm2和2.0×1015ions/cm2時，分別只有負突變菌株和正突變菌株。

2.2.2 干酪乳桿菌突變體的自溶度

由圖3可知，不同劑量N+注入共篩選到正突變變菌株23株，按正突變菌株數量排序可得其中自溶度增大超過15%菌株共有10株，占所有正突變菌株的43.5%。其中自溶度增大最多的正突變菌株出現在注入劑量0.5×1015ions/cm2處，最大2株正突變菌株的自溶度分別增加了25.7%和20.1%。

N+注入之所以能夠造成基因的突變是因為在離子注入過程中離子束或因離子注入作用而產生的大量自由基在生物體細胞內的積累，可以造成DNA、蛋白質等生物大分子的損傷[18]。而一旦核酸損傷發生，則細胞內的修復機制就會對損傷進行修復，主要的修復作用為同源重組和非同源末端連接，一般前一修復機制比較準確基本不會發生錯誤，而后一修復機制則具有較高的出錯率，從而經常導致堿基的改變、缺失或錯位插入，從而使生物體產生突變體[19]。

2.3 最大正突變菌株的遺傳穩定性

由于生物體細胞內存在著嚴格的修復和糾錯機制，所以篩選得到的氮離子誘變所導致的突變菌株在多次的傳代培養中，有可能在生物體本身的同源重組修復機制的作用下，將產生的錯誤進行修復[18,20]。因此，需要采用連續傳代培養的方式，確保所得突變的遺傳穩定性。本研究中選取上述研究結果中的最大正突變的菌株，進行連續的傳代培養并分別檢測每一代的自溶度，連續傳代培養10代的各代菌株自溶度結果如圖4所示，其中最大自溶度為56.73%，最小自溶度為52.67%，則最大的自溶度差異為4.08%。因此，經過最大正突變菌株經過10代傳代培養后，10代間自溶度波動范圍都在5%以內且通過統計分析代與代之間自溶度不存在統計學上的顯著性差異(P>0.05)，表明經過N+注入誘變后，最大正突變菌株獲得了具有良好遺傳穩定性的自溶度突變菌株。

2.4 最大正突變菌株與野生型菌株自溶過程中形態變化

如圖5中所示，在相同的自溶條件和自溶時間下，野生型干酪乳桿菌116-a屬于低自溶菌株，所以經過誘導自溶后僅有少量細胞發生胞內內容物的逸出物，而菌體仍整體保持較飽滿的狀態；而在最大正突變菌株中由于自溶度的增大，菌體細胞的飽滿度開始降低，菌體細胞出現較明顯的凹陷和萎縮，部分細胞可以看到小孔洞的出現，同時更多菌體細胞內容物出現逸出。

2.5 AcmA和GlcNAcase實時熒光定量PCR的引物特異性和擴增效率

所有用于RT-qPCR的引物，在使用前都需要保證其特異性，不能存在非特異性產物和引物二聚體[21]。本試驗中用到的各引物的擴增產物結果如圖6中所示，各引物擴增產物均只存在單一條帶，各條帶所在位置與設計引物產物大小相符，在100 bp附近也不存在引物二聚體。此外，在RT-qPCR過程中檢測到的熔解曲線，也都只出現單一的信號峰，其特異性熔解溫度分別為16S，82.4 ℃；AcmA，83.6 ℃；GlcNAcase，72.7 ℃進一步表明試驗中所用引物具有優良的特異性，保證了試驗結果的可靠性。

為了確保引物的擴增效率，本試驗中以梯度稀釋的cDNA為模板，分別進行RT-qPCR擴增，繪制各基因的標準曲線，得到引物的相關參數如圖7所示。從圖中可以看到內參基因16S rRNA和2個目的基因的線性均良好，線性相關系數均在0.99～1.00范圍內，其中16S rRNA：y=-3.191 7x+21.661,R2=0.991 3；AcmA：y=-3.249 8x+30.221，R2=0.997 4；GlcNAcase：y=-3.401 7x+33.747，R2=0.994 7。依據公式E=(10-1/slope-1)×100[22-23]計算各引物對擴增效率，分別為16S rRNA：105.7%，AcmA：103.1%，GlcNAcase:96.8%。實驗中所用的擴增引物得擴增效率均處于90%～110%之間，符合RT-qPCR對引物擴增效率，保證了實驗數據的準確和可靠。

2.6 AcmA和GlcNAcase在野生菌和最大正突變菌株中的表達差異

通過RT-qPCR研究AcmA和GlcNAcase在野生菌和最大正突變菌株中的表達差異發現，AcmA和GlcNAcase在最大正突變菌株中的表達均比野生菌株中的表達發生了上調，其中最大正突變菌株中GlcNAcase的基因表達比野生菌中的表達上調了55倍，而AcmA的基因表達僅上調了2.8倍(結果如圖8所示)。這表明在最大正突變菌株中GlcNAcase表達的增加可能是導致菌體自溶度增加的重要原因。

AcmA和GlcNAcase是肽聚糖水解酶中的重要組成，兩者均可用于水解連接N-乙酰胞壁質酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，其中前者通過解離N-乙酰胞壁質酸的還原基團實現糖苷鍵的破壞，而后者則通過解離N-乙酰葡萄糖胺的還原基團來實現糖苷鍵的破壞[24-25]。在正常的生長環境中，肽聚糖水解酶被精確的調控用于母代子代細胞間的細胞壁分離，而當正常調控系統受到外界的阻撓或環境脅迫時，對肽聚糖水解酶的調控就失去控制，此時肽聚糖水解酶將導致菌體的自溶[26-27]。因此，菌體的自溶與肽聚糖水解酶的表達量和活性大小都密切相關。這也是GlcNAcase的表達量上調導致菌體自溶增加的原因。此外，干酪乳桿菌中存在的肽聚糖水解酶約有十幾種，并不是所有的肽聚糖水解酶均在菌體的自溶中發揮重要作用[28]。從上述結果來看GlcNAcase是干酪乳桿菌自溶中關鍵肽聚糖水解酶可以有效調節自溶的發生，而AcmA在干酪乳桿菌自溶中所起的作用則有限。

3 結論

(1)低劑量的N+注入誘變作為一種較新型的微生物誘變育種技術，可以高效地用于微生物菌種的誘變和選育，本研究中野生型低自溶干酪乳桿菌116-a經過注入劑量0.5×1015ions/cm2的N+注入誘變篩選得到自溶度增加25.6%的自溶突變菌株。

(2)實時熒光定量PCR分析比較野生菌株和突變菌株的AcmA和GlcNAcase的基因表達發現與野生菌株中的肽聚糖水解酶GlcNAcase的表達量相比，最大正突變菌株中的肽聚糖水解酶GlcNAcase的表達量上調了55倍，表明肽聚糖水解酶GlcNAcase是影響干酪乳桿菌116-a自溶的重要肽聚糖水解酶，在調節干酪乳酸菌自溶中起著作用，而肽聚糖水解表達量的增加可以有效的提高菌體的自溶度。