高溫敏感型酵母的選育及其自溶物研究

張明芳，王金晶，鈕成拓，鄭飛云，劉春鳳，李崎*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 釀酒科學與工程研究室，江蘇 無錫，214122)

酵母含有豐富的蛋白質(45%～60%)、氨基酸、B族維生素、多糖、礦物質等，其自溶物被廣泛應用于調味品、化妝品、保健品、醫藥等領域[1]。酵母自溶物是利用酵母自溶的特性，降解菌體內的蛋白質、核酸類等物質得到的產品[2]。目前生產酵母自溶物的原料主要來自于啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母這3大食用酵母。國內主要以面包酵母生產為主，但由于我國具有豐富的啤酒酵母資源，近年來對于啤酒酵母的開發也引起了關注[3]。

酵母自溶物的營養物質包含多糖、多肽、核苷酸及其他可溶性物質。多糖主要是由于細胞壁降解得到的。細胞壁多糖組分中的葡聚糖是主要的活性物質之一，具有增強免疫系統、保護皮膚細胞免受環境污染、延緩細胞衰老等功能[4]，除了具有生物活性之外，β-葡聚糖還有改善食品風味的作用。在葡萄酒陳釀過程中，酵母細胞溶出的β-葡聚糖能夠改善酒體口感和泡沫穩定性，因此在葡萄酒釀造中往往需要促進β-葡聚糖的溶出[5]或添加酵母多糖[6]。在酸奶中添加β-葡聚糖還有助于提高酸奶的感官接受度[7]。而多肽是酵母自身酶系降解大分子蛋白質得到的。酵母多肽由于分子量小，不僅易于吸收和利用，還具有調節免疫力，抗氧化等功能[8]。因此，富含生物活性物質和較高抗氧化活性的酵母自溶液具有作為功能性食品或營養成分的潛在應用價值[9]。

工業上生產酵母自溶物普遍采用自溶法。通過優化自溶時間[10]、溫度[11]、pH和添加助溶劑[12]可促進酵母的自溶，其中溫度是影響較大的因素。但是傳統的自溶溫度較高(45～55 ℃)，不利于維持多肽及氨基酸等活性物質天然結構[13]。據報道，啤酒酵母在36 ℃下自溶6 h可獲得具有最高抗氧化活性的酵母自溶物[14]。目前，對于提高酵母自溶物抗氧化活性的研究多集中于自溶條件的優化，而對直接改造酵母菌株自溶性能的研究較少。

為了促進酵母自溶、提高自溶物中活性物質的含量和抗氧化活性，本研究通過常溫等離子誘變(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)手段，以啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母為出發菌株，篩選出了3株在37 ℃下快速自溶的高溫敏感型酵母，比較了原始菌與突變菌的自溶程度差異，并分析了自溶物活性物質溶出和抗氧化性的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養基

啤酒酵母pilsner、安琪面包酵母AQ和葡萄酒酵母D254均為工業酵母菌株；高溫敏感型酵母P-510、A-14、D-12分別由pilsner、AQ、D254篩選得到；以上菌株均保藏于實驗室。

YPD培養基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨20，葡萄糖20。固體培養基添加瓊脂量為20。

1.1.2 試劑

酵母提取物、蛋白胨，生工生物工程(上海)股份有限公司；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)，Sigma-Aldrich公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、甘氨酸、NaOH，HCl，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ARTP誘變系統，思清源生物科技有限公司；SPX-250生化培養箱，上海躍進醫療器械廠；NanoDrop分光光度計，Thermo Scientific賽默飛世爾科技公司；pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；CX21顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Tecan Infinite 200多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；DC-0506恒溫水浴槽，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 BCIP平板篩選

高溫敏感型酵母細胞受到熱脅迫后易發生自溶，導致胞內物質溶出。因此利用胞內堿性磷酸酶與5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,BCIP)反應生成藍色沉淀這一原理，可根據藍色出現時間與深淺進行突變菌的篩選。BCIP平板篩選方法如圖1所示。將對數期的酵母菌液洗滌后用生理鹽水重懸稀釋，使菌液細胞數達107個/mL。取上述菌懸液10 μL點于ARTP誘變載片上進行誘變處理，功率100 W，氣流量10 SLM。將經過ARTP誘變所得到的菌液稀釋10倍，涂布于含有40 mg/L BCIP的YPD平板，28 ℃培養36 h。通過平板影印法將菌落復制于YPD平板，并將其放置于28 ℃培養，同時將含有40 mg/L BCIP的YPD平板放置于37 ℃培養24 h，挑選菌落顏色變藍的單菌落進行后續測定。

1.3.2 酵母生長性能考察與生長曲線的測定

(1)生長狀況分析：將待測菌株28 ℃培養12 h后取1 mL離心，去上清并洗滌。使用血球平板計數法計數后將菌液濃度調為106、105、104、103個/mL。依次取4個稀釋度的菌液3 μL點種在YPD平板上，分別放置于28和37 ℃培養2～3 d，觀察菌落大小。

(2)死亡率測定：菌株于28 ℃培養24 h至生長穩定期，轉移至37 ℃、180 r/min條件下培養，測定0～72 h間細胞死亡率。菌液用無菌水洗滌后取0.5 mL與0.5 mL亞甲基紫染色液混合，15 min后細胞計數，紫色細胞為死亡細胞[15]。

(3)生長曲線測定：菌種于20 mL YPD培養基中過夜培養，以5%接種量接種至100 mL YPD中，每隔2 h測定OD600，14 h后每隔4 h測定OD600，直至菌體生長至平臺期。

1.3.3 自溶液中核酸、蛋白質、氨基酸態氮含量測定

收集5.00 g酵母泥，并加入50 mL檸檬酸緩沖液(pH 4.0)中，于180 r/min、37 ℃自溶48 h，測定上清液核酸、蛋白質、氨基酸態氮的含量。

核酸含量測定：吸取上清2 μL使用微量分光光度計NanoDrop[16]測定RNA含量(ng/μL)。

(1)

蛋白質含量測定：吸取上清50 μL使用Brandford法測定蛋白質含量(mg/mL)。

(2)

氨基酸態氮含量測定：吸取上清1 mL使用甲醛法[17]測定氨基酸態氮含量(g/100 mL)。

(3)

1.3.4 自溶液中葡聚糖水平測定

通過苯胺藍法[18]測定自溶液中葡聚糖水平。取1 mL自溶液12 000 r/min離心5 min，吸取上清液100 μL加入1 mL苯胺藍工作液，50 ℃暗反應保溫30 min使熒光物質形成，置于室溫30 min，徹底混勻，吸取180 μL至黑色96孔板進行檢測。激發波長為405 nm，發射波長為495 nm，測定反應液熒光值。

1.3.5 自溶液中DPPH清除率測定

以DPPH清除率為指標表征自溶液的抗氧化能力。采用分光光度計法，無水乙醇配制0.507 2 mmol/L DPPH自由基醇溶液后，取1 mL DPPH自由基醇溶液與1 mL自溶液混合，避光反應30 min測定其OD517值。DPPH清除率計算如公式(4)所示：

(4)

式中：A0，DPPH溶液與無水乙醇混合后測定的OD517值；Ai，DPPH溶液與樣品反應測得OD517值；Aj，無水乙醇與樣品混合反應后測得OD517值。

2 結果與分析

2.1 BCIP平板初篩

啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母是3大食用酵母，被廣泛應用于酵母自溶物的生產[2]，因此本實驗同時對這3種酵母進行高溫敏感型突變菌的篩選。選擇用于商業生產的啤酒酵母pilsner、面包酵母AQ和葡萄酒酵母D254作為出發菌株。ARTP誘變方法能夠在大氣壓下產生等離子體射流從而導致基因突變，具有突變率高、易獲得遺傳穩定性良好的突變株等特點，在誘變育種研究中被廣泛應用[19]。誘變時間影響致死率，致死率過高可能會導致菌株性能大幅度改變，過低又會導致誘變效率降低，一般選擇75%～85%的致死率。因此本實驗選擇的誘變時間為45～46 s，此時致死率大約為80%(圖2)。

將誘變后的菌液涂布至BCIP平板進行篩選，挑選短時間內藍色較深的突變菌進行后續測定，共得到16株啤酒酵母突變菌、14株面包酵母突變菌和12株葡萄酒酵母突變菌(圖3)。

2.2 突變菌的RNA溶出率

突變菌在37 ℃下自溶會導致胞內物質如RNA、蛋白質溶出，因此可通過自溶物中RNA的含量來快速判斷酵母自溶程度，以其相對原始菌自溶物的RNA含量表示，結果如表1所示。

大部分突變菌的自溶液RNA溶出率都高于原始菌，說明BCIP平板篩選法能夠用于啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母的高溫敏感型突變菌的篩選，具有普適性。突變菌中P-510、A-14、D-12的自溶液RNA溶出含量最高，分別為各自原始菌自溶物RNA含量的239.51%、216.12%、216.80%。因此最終選擇P-510、A-14、D-12這3株高溫敏感型突變菌進行后續分析。

2.3 高溫敏感型突變菌的性能考察

2.3.1 高溫下的生長狀況和死亡率

為了進一步分析突變菌在37 ℃的生理性能，測定了其在37 ℃的生長狀況(圖4)和死亡率(圖5)。P-510、A-14、D-12均能在28 ℃正常生長，但A-14的生長略微弱于AQ。同時P-510、A-14、D-12均在37 ℃表現出明顯的生長抑制。在37 ℃下培養12 h后，Pilsner、AQ和D254的死亡率變化不明顯，72 h后死亡率分別為4.2%、13.4%和2.5%，P-510、A-14和D-12的死亡率迅速增加，72 h后分別達到87.8%、79.00%和87.9%，說明突變菌P-510、A-14和D-12對高溫敏感，不能在37 ℃下正常生長。

2.3.2 突變菌的生長曲線

誘變可能會對菌株的生長能力造成影響，因此測定了突變菌的生長曲線，如圖6所示。

3株突變菌和原始菌同時進入對數期，約6 h達到對數期中期。突變菌進入平臺期后菌濃比原始菌略低，但菌株總體生長一致，說明經過誘變處理后突變菌的生長能力略微受到影響。

2.4 突變菌與原始菌的自溶物分析

2.4.1 突變菌自溶程度分析

核酸、蛋白質、氨基酸態氮抽提率可用于衡量菌株的自溶程度。測定了原始菌和突變菌在37 ℃下的核酸、蛋白質、氨基酸態氮抽提率(圖7)。

大部分菌株的RNA和蛋白質的溶出在48 h內呈上升趨勢，而氨基酸態氮的溶出在36 h到達峰值。對于核酸抽提率，自溶36 h后突變菌P-510、A-14、D-12相比于原始菌Pilsner、AQ、D254分別提高了2.7、1.8、1.7倍；對于蛋白質抽提率，36 h后突變菌相比于原始菌分別提高了2.2、1.7、1.6倍；對于氨基酸態氮抽提率，36 h后突變菌相比于原始菌分別提高了1.3、1.2、1.2倍。其中P-510的核酸、蛋白質、氨基酸態氮抽提率最高，分別能夠達到3.52%、0.32%和7.01%。綜上，在37 ℃下突變菌胞內物質的溶出率均高于原始菌，說明突變菌的自溶程度高于原始菌，其中P-510的自溶程度最高。

2.4.2 突變菌與原始菌β-葡聚糖溶出差異

自溶過程中細胞壁受到壓力，多種水解酶作用于細胞壁，隨后細胞壁組分溶出，其中包括生物活性物質β-葡聚糖[20]。β-葡聚糖的水平用相對熒光單位(relative fluorescent unit,RFU)表示，如圖8所示。P-510、A-14和D-12的β-葡聚糖溶出分別為5 332、5 157、4 851.5 RFU，比各自原始菌高出26.0%、10.3%和36.6%，說明突變菌的高溫敏感性狀使其在37 ℃下自溶時溶出β-葡聚糖含量增加。β-葡聚糖是良好的生物活性物質，并在食品、化妝品等領域中被廣泛應用[21]。因此本實驗篩選出的高溫敏感型突變菌能夠增加自溶物中β-葡聚糖的含量，具有在功能性食品中應用的潛力。

2.4.3 不同溫度下自溶物抗氧化活性差異

酵母自溶物具有一定抗氧化性，主要是由于酵母自溶過程中蛋白質降解成活性肽，以及細胞壁組分溶出的葡聚糖和甘露聚糖等物質具有抗氧化性[22]。P-510在37 ℃的自溶物DPPH清除率在60 h達到最高值，比Pilsner在50 ℃的自溶物DPPH清除率高出13.3% (圖9)。D-12在37 ℃的自溶物DPPH清除率也在60 h達到最高值，比D254在50 ℃的自溶物DPPH清除率高出6.8%。同時Pilsner和D254在50 ℃的自溶物DPPH清除率在84 h達到最高值，晚于其突變菌達到最高值的時間。與上述2株突變菌不同，A-14在37 ℃的自溶物DPPH清除率與AQ在50 ℃的自溶物DPPH清除率同時在84 h達到最高值，而前者比后者高出2.1%。以上數據說明與原始菌在50 ℃下自溶相比，突變菌在37 ℃下自溶能夠促進活性物質的溶出，且得到抗氧化活性更高的自溶物。可能是由于蛋白酶催化蛋白質中肽鍵水解時，溫度會影響多肽鏈的長度、游離氨基酸的數量和氨基酸順序，從而影響自溶液的抗氧化性[13]。因此突變菌P-510、A-14和D-12在37 ℃自溶有利于獲得抗氧化活性較強的酵母自溶物。

3 結論

酵母自溶物具有較高的營養價值和安全性，特別是其具有的生物活性使酵母自溶物的研究逐漸受到關注。為提高酵母自溶物的活性物質含量和抗氧化性，本研究以啤酒酵母、面包酵母和葡萄酒酵母為出發菌株進行ARTP誘變，使用BCIP平板篩選獲得了3株高溫敏感型突變菌；突變菌在37 ℃下生長受到抑制，37 ℃自溶時胞內物質溶出增加，具有較好的自溶能力；突變菌自溶物中β-葡聚糖含量增加，且抗氧化活性提高。因此，篩選得到的菌株P-510、A-14和D-12具有功能性食品的應用前景，在動物飼料、化妝品、醫藥等方面具有重要的應用價值，為進一步開發酵母資源提供依據。但對于溫度影響酵母自溶物抗氧化性的具體原因還需要進一步研究。