云南自然發酵火腿中乳酸菌的分離鑒定及發酵特性研究

趙改名，李珊珊，崔文明，祝超智*，焦陽陽，李佳麒，銀峰，韓明山

1(河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州，450002) 2(內蒙古科爾沁牛業股份有限公司，內蒙古 通遼，028000)

傳統發酵肉制品具有高鹽、低水分的特點，儲存期長，風味獨特，營養價值高[1]。它屬于在自然條件下，經微生物或酶的作用，發生一系列生物化學及物理變化而形成的肉制品[2-3]。目前，我國發酵肉制品發展較慢，主要原因是缺少自主產權的發酵劑，產品品種單一，加工過程難以控制，產品質量難以穩定等。通過篩選適合于肉制品發酵的優良菌株并制備發酵劑，可以使一些產品實現發酵過程的人工控制，并且開發更多樣的發酵肉制品，為發酵肉制品的產業化、規模化生產奠定基礎。

乳酸菌是最早從發酵肉制品中分離出的微生物，與產品品質有密切的關系[4-5]。研究發現，乳酸菌可降低產品pH值，賦予產品特殊的發酵風味，改善組織質構，促進色澤與風味的形成[6-7]。同時，某些乳酸菌能產細菌素，抑制腐敗菌和致病菌生長繁殖[8-10]，甚至還有某些乳酸菌具有降低產品中生物胺[11-13]、降低膽固醇[14]、抗氧化[15]等作用。但并非所有乳酸菌都適合作為肉制品發酵菌株，不同種甚至同一種的不同菌株間特性的差異都會使產品品質產生極大的差別[16-17]。云南火腿是我國重要的傳統發酵風味肉制品，不僅具有獨特的風味與口感，而且具有悠久的歷史與深厚的文化底蘊。本研究擬從云南傳統發酵火腿中分離篩選出符合發酵肉制品標準且產酸能力強、耐鹽性和耐亞硝酸鹽性好的乳酸菌菌株，為云南火腿的工業化生產及肉制品發酵劑的研究與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：云南火腿(農家自制)

試劑：MRS瓊脂、MRS肉湯，北京路橋技術股份有限公司；瓊脂、牛肉浸粉、蛋白胨、酵母提取物，北京奧博興生物技術有限責任公司；細菌DNA提取試劑盒，北京天根試劑；CaCO3、NaCl、NaNO2、葡萄糖、MnSO4、MgSO2、乙酸鈉、檸檬酸鈉、MnO2、KOH等均為分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD無菌操作臺，美國Airtech公司；TGradient梯度PCR儀，德國Biometra公司；EC3-310凝膠成像系統，美國UVP公司；DYY-12電泳儀，北京市六一儀器廠；DHP-9272低溫培養箱，上海一恒科技有限公司；ECLIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡，日本尼康公司；UV-2600紫外分光光度儀，日本島津(Shimadzu)公司；Easy MIX拍擊式均質儀，梅里埃診斷產品(上海)有限公司；VORTEX-2 GENIE渦旋震蕩器，美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化及初步篩選

參考《GB 4789.35—2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》，稱取樣品25 g，剪碎，加入225 mL無菌生理鹽水，用均質機均質，并用無菌生理鹽水依次做10倍稀釋，選擇3個適宜稀釋度，分別取200 μL稀釋液涂布于MRS+3% CaCO3(質量分數)培養基平板上，37 ℃培養24～48 h。挑選有明顯溶鈣圈且符合乳酸菌菌落形態的菌落，反復劃線純化。對純化好的菌株進行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗，選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、且不形成芽孢的菌株作為初篩菌株。

1.3.2 菌株復篩試驗

產酸能力測定：將活化3代的菌液接種于液體培養基中，37 ℃下培養24 h，測定pH。

發酵性能測定[18-19]：葡萄糖產氣試驗、H2S產生檢測試驗、精氨酸產氨試驗、過氧化氫產生檢測試驗。

NaCl和NaNO2耐受性測定：參考張曉東[20]的方法進行測定。

生長曲線和產酸曲線的測定：參考潘曉倩等[21]的方法進行測定。

不同溫度條件下的生長能力測定：將活化3代的菌液接種于液體培養基中，分別在10、20、30、40、50 ℃條件下培養24 h，測定菌液的OD600。

不同pH條件下的生長能力測定：將活化3代的菌液分別接種于pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0液體培養基中，37 ℃條件下培養24 h，測定菌液的pH。

1.3.3 生理生化鑒定

采用生化鑒定試劑盒進行糖醇發酵實驗，參考《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行初步鑒定。

1.3.4 16S rDNA 分子生物學鑒定

按照細菌DNA提取試劑盒說明書進行DNA 提取，并以所得DNA 為模板，用細菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)作為上下游引物進行PCR擴增。PCR體系(30 μL)：buffer 3 μL，dNTP 2 μL，模板1 μL，引物27F 3 μL，引物1492R3 μL，酶0.2 μL，ddH2O補至終體積30 μL；PCR擴增條件：第1階段：95 ℃預變性5 min；第2階段：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；第3階段：72 ℃延伸10 min。

PCR產物經凝膠電泳分析后，送北京六合華大基因科技有限公司(武漢分公司)測序，應用BLAST程序，將測序結果在GenBank基因數據庫中進行同源性比較以鑒定菌種歸屬。

1.4 數據統計處理與分析

所有實驗均重復3次，實驗結果表示為平均值±標準差。采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析，數據間的分析采用單因素方差分析(one way ANOVA)和Duncan多重比較法，顯著性水平均設定為P<0.05。生長曲線及產酸曲線的結果使用Origin Pro 8.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和初步篩選結果

從云南火腿中通過MRS+3% CaCO3的培養基篩選乳酸菌，多次純化后，挑選有明顯溶鈣圈且具有典型乳酸菌菌落特征，革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌株。共得到20株乳酸菌，并分別編號為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18、H19、H20。

2.2 菌株的產酸能力

乳酸菌菌株的產酸性能是決定加工發酵肉制品成功與否及安全性的重要因素[22]。由圖1可知，所有菌株在24 h pH均達到4.0以下。選取產酸能力較強的9株菌，即24 h pH≤3.85的菌株進行后續試驗。

2.3 菌株的發酵性能

菌株的發酵特性決定其是否能作為肉制品發酵菌株。篩選的菌株若具有產H2S、產H2O2、精氨酸產氨、葡萄糖產氣等特性會嚴重影響產品的質構、風味、色澤等，使產品品質降低[23]。由表1可知，上述9株菌均不具有以上特性，符合篩選要求。菌株若有適當的蛋白分解能力可增加產品的風味，但以上菌株均不具有蛋白分解能力，這與RAQUEL等[24]的研究一致。并且有研究表明[25-27]，在發酵肉制品中產生風味的主要是微球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，并非乳酸菌。乳酸菌菌株可與微球菌和凝固酶陰性葡萄球菌或風味蛋白酶復配使用，從而使產品產生更多的風味物質。菌株的脂肪分解能力容易使產品腐敗變質，從而縮短產品的貨架期，所以菌株不應具有脂肪分解能力。綜上所述，上述9株菌的發酵特性均符合要求，可作為肉制品發酵劑的潛在菌株。

注：“-”表示反應呈陰性；“+”表示反應呈陽性

2.4 菌株對NaCl的耐受性

發酵肉制品中食鹽的添加量一般為質量分數2%～3%，在一些特殊的產品如色拉米香腸的加工中，食鹽添加量更高。隨著發酵的進行，水分含量的降低，食鹽含量也會相對提高，所以要求篩選的菌株有較好的NaCl耐受性。由圖2可知，不同菌株對NaCl的耐受性存在顯著性差異(P<0.05)；陳衛等[28]也表明，即使是相同的屬不同的種，甚至不同亞種的乳酸菌，耐鹽能力也會有所不同。當NaCl添加量達到6%時，菌株生長受到不同程度的抑制。其中H8的耐受性最好(2.69→2.08)，H4的耐鹽性最差(2.50→1.52)。這可能是因為高鹽濃度會引起高滲透壓，觸發細胞內水分外流，使細胞胞質分離，從而引起細胞在結構和生理上的損傷，導致細胞停止生長，甚至死亡[29-30]。

2.5 菌株對NaNO2的耐受性

發酵肉制品中添加亞硝酸鹽有促進發色、增加風味、抑制微生物的作用，尤其可以有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌[31]。但過量的亞硝酸鹽會對人體造成潛在的危害，國標中對亞硝酸鹽在食品中的添加量有明確的規定。該試驗添加的亞硝酸鈉的最大量為150 mg/kg，由圖3可知，不同菌株對NaNO2的耐受性存在顯著性差異(P<0.05)。但當NaNO2添加量為150 mg/kg時,OD值均在2.0以上，整體表現出較好的NaNO2耐受性，這說明當遇到NaNO2脅迫時，菌株自身有較好的調節能力。這可能與菌株的相容性調控系統、熱休克蛋白調控系統、糖酵解關鍵酶調控系統以及胞內離子平衡等有關[32]。

綜合考慮上述所有指標，選擇符合發酵肉制品標準要求且產酸較好，NaCl和NaNO2耐受性最好的菌株即H8為目標菌株，進行下一步試驗。

2.6 菌株在不同溫度條件下的生長能力

發酵肉制品的發酵溫度一般為15～40 ℃[33]。由圖4可知，不同溫度條件下菌株的生長能力存在顯著性差異(P<0.05)，在10 ℃條件下生長受到抑制，20～40 ℃均能較好的生長，且在30 ℃條件下生長最好，而在李建等[34]的研究中，其優勢菌株在40 ℃條件下生長最好，這種差異可能是由菌株的不同引起的。

2.7 菌株在不同pH條件下的生長能力

隨著發酵的進行，發酵肉制品的pH不斷降低，所以要求菌株對酸有一定程度的耐受性。由圖5可知，菌株在不同pH值條件下的生長存在顯著性差異(P<0.05)。菌株在pH 4.0時仍能較好的生長，適合作為肉制品發酵劑潛在菌株。

2.8 菌株的生長曲線和產酸曲線

如圖6所示，0～2 h內為延滯期，時間較短，在此期間內，生長速度和產酸速度較慢。2～7 h內為對數生長期，此階段OD600由0.19增加至2.25。此外，該菌株的產酸能力較強，其中主要在對數生長期產酸較多。菌株生長速度和產酸速度快有助于在肉制品中的快速定植、生長及產酸，從而抑制其他腐敗微生物的生長，保證產品的質量[35]。

2.9 菌株鑒定

2.9.1 形態及生理生化鑒定

菌株H8呈乳白色圓形菌落，直徑1～2 cm，表面光滑凸起；鏡檢結果如圖7所示，為革蘭氏陽性球菌，無鞭毛、無芽孢。生理生化鑒定結果如表2所示，根據形態及生理生化鑒定結果，對照《常見細菌系統鑒定手冊》，初步將H8菌株鑒定為片球菌屬細菌。

注：“-”表示反應呈陰性；“+”表示反應呈陽性。

2.9.2 分子生物學鑒定結果

經16S rDNA測序，得到長度為1 246 bp的H8菌株16S rDNA序列。用BLAST進行序列同源性比對，并利用MEGA 6.06構建系統發育樹，結果見圖8。

由系統發育樹可知，H8菌株與戊糖片球菌親緣關系最近，這與形態及生理生化鑒定結果一致，由此可以進一步將H8菌株歸屬于戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

3 結論

本實驗以云南火腿為原料，初步篩選得到20株革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性、符合乳酸菌基本特征且具有明顯溶鈣圈的菌株。通過研究菌株的產酸能力、發酵特性及對NaCl和NaNO2的耐受性，得到1株性能較好的菌株，經形態學、生理生化和分子生物學鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。該菌株在不同pH和不同溫度條件下的生長能力均符合發酵肉制品菌株的基本要求，且該菌株生長速度和產酸速度較快，生長延滯期短，可作為肉制品發酵劑的潛在菌株。