油樟內生細菌分離及α-松油醇高產菌株的篩選與誘變

黃金鳳，王鑫，梁玉娟，楊立艷，羅思燦，鄒月，魏琴*，梁寒峭

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039) 2(宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓，644000) 3(北京城市學院 生物醫藥學部，北京，100094)

油樟[Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N．Chao]屬樟科常綠喬木，是中國特有經濟樹種，主產于四川省宜賓市[1]。油樟植株根、莖、葉、果實均可用于提煉精油，其葉為主要產油器官，含油量高達3.8%～4.5%[2-3]。油樟油富含幾十種不同沸點的物質成分，其中α-松油醇為其主成分之一，相對含量在10%以上。α-松油醇作為食品添加劑，除具有類似紫丁香的宜人香氣，還具有各種生物和藥物特性，如抗氧化、抗癌、抗驚厥、抗潰瘍、抗腹瀉等，被認為是最常用的香料化合物之一[4-6]。α-松油醇存在于多種植物精油中，但物質含量較低，從植物源獲取α-松油醇需克服植物生長周期問題，考慮植被破壞、廢渣污染等影響，所得α-松油醇也難以滿足日益增長的市場需求，因此，實際使用的α-松油醇主要通過化學合成松油醇后再精制而得。目前，工業合成松油醇分為一步法與二步法，通過無機液體酸(H2SO4、H3PO4等)為催化劑，催化工業蒎烯或松節油水合合成松油醇[7-9]。其中，二步法所得松油醇純度較高、香氣較正但工藝繁瑣，成本高昂，一步法雖較為簡單，但所得松油醇香氣較差。工業合成松油醇雖能滿足市場需求但其香味不及天然松油醇純正，且生產工藝以無機酸為催化劑，加重環境污染，設備腐蝕嚴重，增加生產成本[7,10]。近年食品安全問題關注度逐年增長，被譽為“食品工業靈魂”的食品添加劑成為眾矢之的，合成的香精香料與人們對天然風味物的追求已不相適應[11]。

植物內生菌指生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內部的微生物，可通過組織學方法從表面嚴格消毒的植物組織中分離出來。經報道，許多內生菌由于與宿主的長期共處，與后者形成了互利共生關系[12-13]；部分內生菌可以產生與宿主細胞相同或相近的活性物質[14]，分離培養植物內生菌可為獲取其宿主植物活性物質提供新思路。王濤等[15-16]從油樟植株分離內生細菌和芽孢內生細菌，根莖葉共分離203株內生細菌和40株芽孢內生細菌，其中葉的分離量均不超過20株，未能充分挖掘油樟葉內生細菌多樣性。本研究擬采用3種(組織塊、研磨、中和劑)處理方法分離油樟葉內生細菌，旨在獲取更豐富的內生細菌資源；并對α-松油醇高產內生細菌進行篩選及誘變育種，為進一步開發利用高產菌株生產α-松油醇奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源

根據前期研究結果，以宜賓市高縣月江森林經營所紅巖山油樟母本園中油樟產油率和成分相對含量存在差異的5株油樟株系葉片為材料(表1)。

1.1.2 培養基

LB營養瓊脂、胰酪大豆胨瓊脂培養基(tryptose soya agar,TSA)、卵磷脂吐溫-80營養瓊脂均為成品培養基，杭州百思生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑

細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、PCR通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3’；1492R：5’ -ACGGT TACCTTGTTACGACTT -3’),上海生工生物工程公司提供和合成；中和劑：質量分數0.5%甘氨酸，體積分數3%吐溫-80，磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH 7.2)；乙醇、NaClO、MgSO4為分析純、二氯甲烷為色譜純,成都科隆化學品有限公司；

1.2 方法

1.2.1 油樟葉表面消毒處理

1～5號油樟葉于流水沖洗10 min后，在無菌條件下按無菌水2次(30 s/次)→體積分數75%乙醇2 min→無菌水2次(30 s/次)→體積分數2% NaClO(按有效氯含量計算)5 min→無菌水4～5次(30 s/次)程序進行表面消毒，備用。實驗設置漂洗對照、印記對照和環境對照。

1.2.2 中和劑濃度的篩選

無菌條件下，稱取1 g經消毒的油樟葉于無菌研缽中，剪碎，依次添加體積分數為0，10%，30%，50%，70%，90%經121 ℃滅菌15 min的中和劑9 mL，充分研磨，各取200 μL接種LB培養基，重復3次，36 ℃恒溫培養1～2 d，觀察出菌情況，篩選最適中和劑濃度。

1.2.3 內生細菌的分離

無菌條件下，取表面徹底消毒的1～5號油樟葉片，吸干表面水分，(1)用無菌鑷子和剪刀裁去油樟葉葉柄及組織邊緣，沿著葉脈將其剪成0.5～1 cm的組織塊，備用；(2)稱取1g油樟葉于無菌研缽中，剪碎后加入9 mL無菌蒸餾水，充分研磨，備用；(3)稱取1g油樟葉于無菌研缽中，剪碎后加入9 mL最適濃度中和劑，充分研磨，備用。將上述組織塊及研磨液分別接種LB、TSA和卵磷脂吐溫-80營養瓊脂培養基，組織塊每皿接種5片，研磨液每皿接種200 μL，設置5個重復，36 ℃恒溫培養，每24 h觀察出菌情況并計數。

1.2.4 內生細菌分子鑒定

按同方法同樣本同培養基原則挑取特征菌落于液體培養基，36 ℃、140 r/min培養12 h。按細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取DNA并進行PCR擴增。25 μL PCR反應體系為：12.5 μLTaqPCR Master Mix (2x)，1 μL DNA模板，1 μL 10 μmol/L 引物27F，1 μL 10 μmol/L 引物1492R，用Sterilized ddH2O 補足至25 μL。擴增程序：94 ℃ 4 min；30個循環94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物送上海生工生物工程公司進行16S rDNA序列測定，測定序列提交GenBank進行Blast同源性匹配。

1.2.5 α-松油醇高產菌株的篩選

樣品制備：油樟葉內生細菌接種至40 mL LB液體培養基，36 ℃，140 r/min搖床培養12 h。將二氯甲烷與菌液按1∶1(mL∶mL)混合，超聲破碎20 min后充分混勻，靜置。取有機相，添加適量無水MgSO4，靜置過夜。吸取1 mL二氯甲烷萃取液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，進行GC-MS(安捷倫7890A-5975C)分析檢測。

GC條件：HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣(He)；流速1 mL/min，不分流進樣，進樣口溫度220 ℃；柱溫60 ℃用于0 min，然后10 ℃/min 到190 ℃，保持 2 min，5 ℃/min 到 210 ℃保持2 min，然后 10 ℃/min 到 220 ℃保持 8 min。運行30 min。

MS條件：接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；質量掃描范圍45～300 u。

1.2.6 α-松油醇高產菌株的誘變選育

將α-松油醇高產菌株按10倍梯度用PBS緩沖液稀釋到適當菌種濃度后，取100 μL涂布LB培養基，放置帶菌平板于30 W、30 cm紫外燈處，進行紫外誘變。誘變以30 s為時間間隔，隨后36 ℃避光倒置培養12 h，計算致死率。挑取誘變菌株接種LB液體培養基，36 ℃，140 r/min搖床培養12 h后，制樣，進行GC-MS分析檢測。致死率計算如公式(1)所示，

(1)

1.2.7 α-松油醇誘變菌株遺傳穩定性檢測

對篩選到的誘變菌株進行連續傳代培養，采用平板劃線傳至第5代，測定子代產α-松油醇的穩定性。

1.2.8 數據分析

數據采用DPS 7.05進行統計分析，origin 8.0軟件作圖。α-松油醇含量采用外標法進行定量分析檢測。

2 結果與分析

2.1 中和劑濃度的選擇

如表2所示，隨著中和劑濃度的增大，油樟葉內生細菌分離量呈先上升后下降的趨勢。在中和劑體積分數為50%時，油樟葉內生細菌數量最高達到4.9×103CFU/g 葉重。繼續增大中和劑濃度，油樟葉內生細菌數量開始遞減，說明高濃度下的中和劑對油樟葉內生細菌的分離存在抑制作用。

2.2 不同處理方法分離油樟葉內生細菌的結果

3種培養基中，組織塊法接種75皿375片油樟葉組織塊，5 d內僅有3.2%組織塊長出13株內生細菌；研磨法接種75皿，5 d內48皿長出內生細菌181株；在中和劑作用下，接種75皿培養基，5 d內51皿長出內生細菌458株，見表3。3種處理方法分離效果依次為中和劑輔助法>研磨法>組織塊法。研磨法分離內生細菌數量遠大于組織塊植入，可能因為研磨處理使內生細菌從組織分散到勻漿液，更多內生細菌直接或更快吸收培養基營養，從而生長更快。王濤等[15]采用研磨法分離到油樟葉內生細菌13株，少于本實驗研磨法所得數量，這可能受油樟葉采集季節、葉齡、樹齡等[17]因素影響，也可能與所用的營養瓊脂(nutrient agar,NA)培養基有關。其次，中和劑輔助分離油樟葉內生細菌數量遠遠大于傳統研磨法與組織塊法，這可能是中和劑抑制了油樟油抑菌活性。研究表明[18-19]，3.13～12.50 μL/mL濃度油樟油即可顯著抑制多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，而中和劑的加入可能使得油樟油抑菌活性被抑制。也可能是因為中和油樟葉因充分研磨而釋放的黏液，促進內生細菌釋放。

注：T1、T2、T3依次代表組織塊法、研磨法、中和劑輔助法；J、M、Z依次為LB、TSA、卵磷脂吐溫-80營養瓊脂。

2.3 油樟葉內生細菌的16S rDNA鑒定

如表4、表5所示，5株油樟植株共保存176株內生細菌，經鑒定分屬于4個門13個屬的34個種。13個屬包括Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus、Microbacterium、Micrococcus、Rothia、Aerococcus、Pseudomonas、Kocuria、Virgibacillus、Sphingomonas、Acinetobacter、Chryseobacterium。其中，組織塊法保存10株，分屬于1個門4個屬；研磨法保存59株，分屬于3個門7個屬；中和劑輔助法保存107株，分屬于3個門7個屬。Bacillus和Staphylococcus分別為油樟葉內生細菌第一優勢屬和第二優勢屬，占總量的71.02%和11.36%。

34種油樟葉內生細菌中，Micrococcus、Kocuria和Chryseobacterium僅出現在1號油樟株系；Rothia僅出現在3號油樟株系；Microbacterium和Sphingomonas僅出現在4號油樟株系；Aerococcus、Virgibacillus和Pseudomonas僅出現在5號油樟株系，這可能與1～5號油樟植株產油率和1,8-桉葉油素含量差異有關(表1),有待進一步研究。并且,Microbacterium僅用LB培養基分離獲得；Rothia、Sphingomonas和Acinetobacter僅用TSA培養基分離獲得；Micrococcus、Aerococcus、Pseudomonas、Kocuria和Chryseobacterium僅用卵磷脂吐溫-80營養瓊脂分離獲得，這可能與該屬油樟葉內生細菌對培養基營養物質的專一性有關。王濤等[15-16]采用NA培養基分離到Paenibacillus油樟葉內生細菌，本實驗所用培養基均未分離到該屬內生細菌，除與培養基有關，也可能是油樟植株種屬、株號、季節等不同造成的。

2.4 α-松油醇高產菌株的篩選結果

天然的香氣物質除來源植物精油或揮發油外，微生物是其獲取的另一生物途徑。由圖1可知，34種油樟葉內生細菌通過液體培養后，均可在培養液中檢測到不同物質含量的α-松油醇，其中α-松油醇產量最高的為芽孢桿菌屬(Bacillus)的1株內生細菌，菌株編號為T3-M-39(圖2)，其α-松油醇產量為1.075 mg/L。將T3-M-39菌株作為出發菌株進行紫外誘變試驗。

2.5 紫外誘變時間的選擇

紫外線具有較高的殺菌能力和誘變能力，隨著照射時間延長，培養皿中活菌數逐漸減少(圖3)。一般認為，高劑量誘變(致死率90%以上)引發的突變范圍更廣，變異菌株更多，但高劑量誘變下回復突變菌株出現率增大[20]，不利于篩選，且一般認為低劑量可以提高正突變率。目前普遍認為致死率控制在70%～80%時的誘變劑量較為合適[21-22]。如圖4所示，從2.5 min開始，T3-M-39菌株紫外誘變致死率超過80%，2 min時，致死率為74.07%，符合正向突變菌株的理想致死率，故選擇誘變時間2 min作為最佳誘變時間。

2.6 突變菌株產α-松油醇能力及遺傳穩定性分析

如圖5、圖6所示，出發菌株T3-M-39經紫外誘變處理2 min時，其正突變率和負突變率分別為26.04%和14.34%。將出發菌株T3-M-39作為對照，經紫外誘變后，T3-M-39最優正向突變菌株產α-松油醇能力比出發菌株提高了34.85%，顯著高于出發菌株(P<0.05)。對該菌株連續傳代培養5代，測定α-松油醇含量，發現該菌株產α-松油醇能力穩定，未出現回復突變菌株。并且，T3-M-39最優突變菌株子代產α-松油醇含量保持在1.450 mg/L左右，無差異顯著性變化(P>0.05)，說明該菌株具有良好的遺傳穩定性。

3 結論

α-松油醇作為一種允許使用的食品合成香精香料，廣泛用于食品工業。然而，通過化工合成的α-松油醇已難以滿足人們對 “綠色”香精香料的需求。生物法生產香精香料是一種模擬天然動植物代謝過程的方法，其產物已被歐洲和美國食品法規界定為“天然的”[23]。利用微生物采用生物技術是生產天然香精香料的途徑之一。鑒于內生菌的生境特殊性，從植物微生態系統中篩選與宿主植株存在共代謝作用的功能菌株是獲取菌株材料的有效途徑。本實驗采用組織塊法、研磨法、中和劑輔助法共保存176株內生細菌，鑒定分屬于Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus、Microbacterium、Micrococcus、Rothia、Aerococcus、Pseudomonas、Kocuria、Virgibacillus、Sphingomonas、Acinetobacter、Chryseobacterium的34個種。其中，Bacillus為絕對優勢菌屬，這與大多數其他植物內生菌優勢屬研究結果相似[24]。內生芽孢桿菌屬可能較其他內生細菌更易產生宿主植物主要活性物質或前體物質[25-26]。通過對34種油樟葉內生細菌培養液中α-松油醇含量進行GC-MS分析，篩選到1株芽孢桿菌屬高產α-松油醇的內生細菌T3-M-39，說明Bacillus內生細菌在與油樟的相互作用中可能發揮著重要作用。

野生菌株生產能力較低，一般用于生產的菌株需經過菌種改良提高生產能力。基因工程技術在菌種選育方面取得了矚目成就，但利用物理或化學誘變仍然是國內外提高菌種生產能力的重要手段[27]。張建新等[28]采用紫外誘變產β-甘露聚糖酶的黃豆內生菌，使其產酶能力較出發菌株提高了37%。徐婉如[29]對1株分離自秦艽根部的內生真菌QJ18進行80 s紫外照射，發現其產龍膽苦苷的能力比出發菌株提高25.2%。本實驗將T3-M-39菌株作為出發菌株進行紫外誘變，誘變條件為30 W紫外燈30 cm處照射2 min，其最優正向突變菌株α-松油醇產量增至1.451 mg/L，較出發菌株提高了34.85%，且遺傳穩定性良好。說明通過紫外誘變方式提高T3-M-39菌株生產α-松油醇是可行的，結果可為提高α-松油醇產量提供菌株材料，為利用生物法生產α-松油醇奠定基礎。然而本實驗僅采用單一誘變對菌株進行改良，為防止平頂效應[30]，還有待于通過多輪復合誘變或基因工程技術對菌種進行改造，優化發酵工藝條件以提高α-松油醇產量。