米酸湯在發酵過程中品質變化及發酵動力學研究

王容，趙良忠*，李明 ,4，孫孟京 ，謝春平 ，鄧雅欣 ，歐紅艷

1(邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽,422000) 2(豆制品加工技術湖南省應用基礎研究基地，湖南 邵陽,422000) 3(湖南省果蔬清潔加工工程技術研究中心，湖南 邵陽,422000) 4(廣州佳明食品科技有限公司，廣東 廣州,510000)

貴州地域天氣溫潤，腹瀉、痢疾等疾病比較常見。食酸成為貴州人民特有的飲食習慣，其中以酸湯最為著名，故有“三天不吃酸，走路打串串”之說[1-2]。米酸湯味道清香爽口，沁人肺腑。除富含多種維生素和各類微量元素外，還富含氨基酸、有機酸等。

貴州的米酸湯一直采用自然發酵，周期長、產酸低、產品質量不穩定[3-5]。當前大部分研究仍停留在對酸湯中的微生物進行分離鑒定、酸湯發酵工藝優化、營養特征物質以及一些風味物質分析，忽略了對酸湯動力學的研究[5-7]。雖然現在已有學者以苗族地區農家自釀的酸湯為原料，對其中的乳酸菌進行分離鑒定，研究其生物學特性，建立了單一菌種的發酵動力學模型[8]，但對米酸湯混合乳酸菌發酵動力學的研究鮮有報道。本實驗進行了以鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、玉米乳桿菌(L.zeae)、植物乳桿菌(L.plantarum)為混合菌種發酵米酸湯，研究其在發酵過程中品質的變化和發酵動力學。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從豆清液中分離出3株產酸高的Lactobacillusrhamnosus、L.zeae、L.plantarum,由豆制品加工技術湖南省應用基礎研究實驗室提供；大米、糯米,市售；液化酶(酶活4 000 u/g)、糖化酶(酶活120 000 u/g),廣東溢多利生物科技股份有限公司提供；乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸,均為色譜純,北京索萊寶科技有限公司提供；其他化學試劑均為分析純。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺，江蘇通凈有限公司；UV-1780型紫外可見分光光度計，島津公司；GI54DWS型全自動滅菌鍋、le204e型電子天平，長沙艾迪生物科技有限公司；DH-360型電熱恒溫培養箱，DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋、VELOCITY18R型臺式冷凍離心機，澳大利亞達卡米公司；U-3 000高效液相色譜，天津市蘭博實驗儀器設備有限公司；CR-400色彩色差計，廣東七彩儀器設備有限公司；NDJ-5S旋轉黏度計、電子鼻和電子舌，上海瑞玢科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米酸湯發酵(圖1)

1.2.1.1 工藝流程

1.2.1.2 操作要點

(1)浸泡：稱取m(面粉)∶m(大米)∶m(糯米)=2∶1∶1共100 g，凈水洗滌1～2次，在室溫25 ℃的恒溫培養箱中浸泡約6 h。

(2)糊化：加900 g去離子水進行磨漿，再將磨好的米漿加熱到100 ℃并保溫5 min。

(3)液化：在溫度降為85 ℃時，調pH值到6.5，添加1%(質量分數)的液化酶，液化25 min。

(4)糖化：在溫度降為55 ℃時，調pH值到4.0時，添加0.02%(質量分數)的糖化酶，糖化1 h。

(5)滅菌：105 ℃、8 min進行滅菌。

(6)接種：把從實驗室進行活化、擴培、馴化的混合菌，按接種量為5%(V/V)接種于待發酵液中。

(7)發酵：搖床轉速160 r/min，培養溫度36 ℃，每隔6 h取樣測其有機酸、蛋白質、黏度、色差、pH值、感官評分、菌體含量、乳酸含量、殘糖濃度的指標變化。

1.2.2 總酸含量測

參照國標《GBT 12456—2008食品中總酸的測定》[9]。

1.2.3 菌體含量測定方法

用移液槍吸取10 mL發酵液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，用去離子水洗滌3次后，于105 ℃烘干至恒重，稱菌體質量[10-11]。

1.2.4 殘糖量測定

按照3,5-二硝基水楊酸法測定[12]。

1.2.5 蛋白質質量分數測定

參照 GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》[13]的凱氏定氮法。

1.2.6 有機酸測定[14]

取米酸湯10 mL，經過濾后在10 000 r/min下離心20 min，取上清液1 mL，經0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣供分析用。液相色譜條件：色譜柱為CAPECELL PAK MG-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，流動相V(甲醇)∶V(pH=

2.65 0.01 mol/L KH2PO4溶液)=5∶95；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL。

分別準確稱取草酸10 mg、蘋果酸10 mg、檸檬酸10 mg、乳酸10 mg。用重蒸水溶解并分別定容到4個10 mL容量瓶中，得到質量濃度為1.0 mg/mL標準酸原液，密封置于4 ℃冰箱中保存待用，按照表1配制混合酸標樣。采集數據，根據峰面積與質量濃度的關系建立線性回歸方程，見表2和圖2。

1.2.7 色差值

用移液槍準確移取混勻的米酸湯2 mL，以蒸溜水為對照，測定米酸湯的L*(亮度)、a*(紅綠度，正值為紅色,負值為綠色)、b*值(黃藍度，正值為黃色，負值為藍色)，然后按照公式(1)求出ΔE值，ΔE越大表示樣品顏色差異越大。

(1)

1.2.8 黏度測定

量取20 mL米酸湯，采用NDJ-5S旋轉黏度計進行測試。

1.2.9 感官評定

由10名有經驗的食品專業評員組成評定小組，分別對米酸湯的色澤、內部形態、滋味和香氣進行評定，采用百分制，具體的感官評價標準見表3。

1.2.10 米酸湯發酵動力學模型建立

1.2.10.1 菌體生長動力學方程

在菌體生長動力學模型中，最為常用的是Monod和Logistic模型[15-16]，Monod主要用來描述密度較低和生長較慢的菌體，但混合乳酸菌生長較快，到發酵后期菌體濃度很大，采用Monod方程不合適，所以采用描述生長曲線為S形的Logistic模型。結合參考文獻[17-18]，對本實驗中不同階段的混合乳酸菌采用如下方程：模擬菌體生長變化，Logistic 方程[19]；模擬乳酸生成，Luedeking-piret 方程[20]；模擬總糖的消耗，Luedeking-piret 方程[21]。

Logistic方程求積分式見公式(2)：

(2)

式中：CX,菌體生物量,g/L；t,時間；k,微生物的最大比生長速率；Cm,菌體最大生物量,g/L；C0,菌體的初始生物量,g/L。

1.2.10.2 產物生成動力學方程

本實驗采用Luedeking-piret方程[22-23]。通用模型方程如公式(3)：

(3)

式中：P,產酸量,g/L；P0,初始乳酸量,g/L；t，時間，h；n1，與菌體量有關的合成系數[g/(g細胞·h)]；n2，與菌體生長有關的合成系數(g/g 細胞)。

1.2.10.3 基質消耗動力學方程

本實驗中由于混合乳酸菌的生長和產物生成是部分偶聯型，則采用Luedeking-piret方程[24-26]。

(4)

式中：S,底物質量濃度,g/L；S0,初始底物質量濃度,g/L；t,時間,h；r2,底物用于菌體生長的得率系數,g/g；r1,微生物的維持常數，h-1。

1.2.11 電子鼻及電子舌測定風味物質

電子鼻測定:將電子鼻傳感器預熱0.5 h以上，使其達到工作溫度，稱取5 mL樣品于玻璃進樣瓶中，加蓋密封待檢。待進樣瓶中的樣品達到液-氣兩相平衡后，對所需檢測的樣品數據進行采集，設置采樣時間為120 s，氣體流量為0.3 L/min，等待時間為10 s，清洗時間為120 s，每個樣品重復4次。

電子舌測定:將電子鼻傳感器預熱0.5 h以上，使其達到工作溫度，對電子舌傳感器進行完全地清洗，以免影響試驗樣品數據的采集，清洗溶液為去離子水。清洗完成后，設定測定時所需要的相應參數，量取15 mL待測樣品倒入電子舌專用燒杯中，對樣品進行檢測。采樣時間180 s，采樣速度為1次/s，每個樣品平行測定5次。

1.2.12 數據處理

運用IBM SPSS Statistics 22軟件進行數據處理分析，且每組實驗重復3次(結果均以平均值±標準差表示)與相關性分析，應用Origin 9進行擬合求解。

2 結果與分析

2.1 米酸湯在發酵過程中有機酸含量變化結果分析

如表4所示，在米酸湯隨著發酵時間變化過程中所檢測的4種有機酸中，乳酸含量最高，在發酵后期達到了10.360 g/L，酒石酸和蘋果酸含量次之，在發酵后期分別達到了0.191、0.194 g/L。檸檬酸有檢測出，但在發酵后期含量極少，基本沒有。乳酸在0～24 h內隨發酵時間增長緩慢，在24～102 h隨發酵時間呈直線上升，102 h后隨發酵時間基本保持不變。酒石酸的生成曲線基本與乳酸一致，檸檬酸在0～60 h隨發酵時間呈直線上升，在60～96 h隨發酵時間呈下降趨勢，在96 h之后檸檬酸含量基本為0。蘋果酸在18 h之前含量基本為0，在18～96 h隨發酵時間呈上升趨勢，在96 h之后基本保持不變，略有下降趨勢。圖3為120 h時米酸湯中有機酸色譜圖。

注：結果為平均數±標準差。下同。

2.2 米酸湯在發酵過程中感官評分、蛋白質、黏度、色差值和pH值變化結果分析

如表5所示，在米酸湯發酵過程中蛋白質、黏度、pH隨發酵時間的變化都呈下降的趨勢，色差值和感官評分都呈上升的趨勢。蛋白質在0～12 h隨發酵時間下降比較緩慢，在12～96 h隨發酵時間呈直線下降，在102 h之后，蛋白質基本在0.81 g/100 g左右保持不變。黏度在0～12 h隨發酵時間下降緩慢，在12～102 h隨發酵時間呈直線下降，在108 h之后，黏度基本在2.7 mPa·s左右，變化非常小。pH值在0～24 h隨發酵時間呈直線下降，在24 h之后隨發酵時間下降緩慢，在發酵后期基本保持不變。感官評分在0～102 h隨發酵時間直線上升，在102 h到達最高,為(90.38±0.16)分，之后便保持不變。

2.3 米酸湯在發酵過程中品質相關性分析

根據表6進行的米酸湯品質指標之間的相關性分析表明：感官評分與乳酸、蘋果酸、酒石酸呈極顯著正相關關系(r為 0.983、0.914、0.796)，即酸度越高，米酸湯感官評分越高；與色差值呈顯著正相關關系(r為 0.979)，即色差值越大，米酸感官評分越高，可能原因是微生物產生的酶將蛋白質降解成氨基酸,糖類降解成單糖,兩者發生了Mailard反應，產生了類黑精等物質，使顏色發生變化，影響米酸湯的色澤，從而影響感官評分；感官評分與蛋白質、黏度和pH值呈極顯著負相關關系(r分別為-0.983、-0.987、-0.741)。黏度與蛋白質、pH值呈極顯著正相關關系(r為 0.989、0.689)；黏度與感官評分、色差值、乳酸、蘋果酸、酒石酸呈極顯著負相關關系(r為-0.987、-0.953、-0.993、-0.898、-0.713)；一方面可能是混合菌在發酵過程中，未被水解的直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例發生改變,降解了淀粉中的支鏈淀粉，另一方面可能是蛋白質大分子在混合乳酸菌的作用下水解成小分子的肽、氨基酸殘基等小分子物質，使黏度下降，從而影響米酸湯的內部形態和口感。綜上所述，米酸湯在發酵過程中品質指標間有著非常復雜的聯系。

注：**在P<0.01上差異極顯著。

2.4 米酸湯發酵動力學分析

混合乳酸菌在米酸湯中發酵動力學曲線如圖4所示。

混合乳酸菌發酵周期為120 h，混合乳酸菌的生產過程隨發酵變化可分為4個階段。0～8 h為延滯期，菌體增長速度緩慢，總酸合成速度比較低，殘糖的消耗速度也比較低；8～48 h后進入對數期，碳源充足，菌體快速生長，呈直線上升，殘糖消耗也加快，總酸含量持續增多；48～108 h進入穩定期，菌體繁衍后代的速度逐漸下降，相對菌體死亡數開始漸漸增加，此時菌體繁衍子代的數量與死亡數漸漸達到平衡，米酸湯的pH值低，抑制了菌體生長，殘糖消耗基本不變，乳酸合成速度降低，總酸含量基本保持不變；108 h之后菌體含量呈下降模式，進入衰亡期。

2.5 模型擬合求解與檢驗

2.5.1 發酵動力學擬合求解

利用Origin 9對方程(2式)進行線性擬合，得到的方程為：y=0.175 6x-3.685，相關系數R2=0.991 6。由此可得k=0.175 6，Cm=0.122 4。

利用Origin 9將菌體生長穩定期乳酸含量與時間進行線性擬合，得到方程式為：P=0.097 2t+1.192 5，相關系數R2=0.998 5，由此可得n1=0.019 4。將k=0.175 6，C0=0.122 4 g/L，Cm=5 g/L，n1=0.019 4，P0=0.62，代入方程(3式)并過(0，0)點進行線性擬合，得到方程為y=0.535 9x+0.028 4，相關系數R2=0.996 2，由此可得n2=0.535 9。

利用Origin 9取菌體生長穩定時期，將基質殘糖濃度S與時間t進行線性擬合得到：S=-0.044 9t+12.318，相關系數R2=0.881 4，得到r1=0.009。將k=0.175 6，C0=0.122 4 g/L，Cm=5 g/L，r1=0.009，S0=19.15，代入方程(4式)并過(0，0)點進行線性擬合，得到方程為y=1.665 8x+0.416 8，相關系數R2=0.99，由此可得r2=0.166 5(表7)。

將各參數及初始條件值代入模型(2)式、(3)式、(4)式得：

菌體生長動力學模型：

乳酸生成動力學模型：

殘糖消耗動力學模型：

S=50.03-1.485×

2.5.2 模型驗證

為了進一步驗證模型的真實性，用Origin 9得到混合乳酸菌發酵過程的擬合曲線，如圖5所示。從圖5中可以看出3個模型的模型值與實驗值擬合曲線比較理想。模型的相關性均在0.01水平(雙側)顯著相關，菌體生長動力學模型Pearson相關性0.998**；乳酸生成動力學模型Pearson相關性0.999**；殘糖消耗動力學模型Pearson相關性0.992**。較好地反應了實際的發酵過程，表明了模型對米酸湯發酵過程具有一定的指導意義。

2.6 米酸湯成分測定

混合菌發酵米酸湯(本研究混合菌發酵米酸湯發酵4 d時的樣品)、自然發酵米酸湯(不加入混合菌自然發酵的樣品)、貴州米酸湯產品(市場上購買的貴州米酸湯產品)各組分含量見表8。混合發酵米酸湯總酸低于貴州米酸湯產品，其有機酸(乳酸、酒石酸)、還原糖均高于自然發酵米酸湯和貴州米酸湯產品。與自然發酵米酸湯對比，混合發酵米酸湯和貴州米酸湯產品中的蛋白質、乳酸含量均有提高，乳酸占總酸的比例分別是95.98%、71.08%、28.86%，可見，混合發酵米酸湯中有機酸含量最多，都是通過發酵生成的有機酸，而貴州米酸湯產品中有機酸(以乳酸計)只占總酸的28.86%，推測可能是后期發酵完調配了一些無機酸。

注：a,b,c代表不同水平之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.7 風味結果分析

2.7.1 電子鼻

圖6為3種米酸湯的主成分分析(principal component analysis，PCA)，由圖6可知，第一主成分(PC1)的貢獻率為98.6%，第二主成分(PC2)的貢獻率為1.1%，二者之和達到99.7%,大于95%，因此可認為此主成分二維圖能很好地表示出被測樣品的整體信息且成分間干擾小。其區分度(discrimination index，DI)達91.8%，一般情況下認為DI值大于80%區分效果較好，DI值越大表示樣品間的距離越遠，區分的效果越理想。由此可見，3種不同的米酸湯揮發性風味成分有明顯區別。

2.7.2 電子舌

圖7表示3種米酸湯的PCA，由圖7可知，PC1的貢獻率為33.84%，PC2的貢獻率為18.51%，二者之和達到63.56%,小于95%，因此可認為此主成分二維圖不能很好地表示出被測樣品的整體信息且成分間干擾大。其DI達90.27%，由此可見，3種不同的米酸湯的風味成分有明顯區別。

3 結論

通過比較研究米酸湯在發酵過程中感官評分、蛋白質、色差值、pH值和有機酸可知，米酸湯品質指標間有著非常復雜的相關性。

在米酸湯發酵過程當中，描繪了混合乳酸菌株菌發酵的菌體生長、產物合成、底物消耗的動力學曲線；并通過Origin 9非線性擬合得出菌體生長、產物合成、底物消耗的動力學模型；通過比較菌體生長、乳酸合成和總糖消耗模型的實驗值與預測值，結果表明以上模型能夠較好地反映發酵情況，對后續的放大試驗有一定的指導意義。

通過比較混合菌發酵米酸湯、自然發酵米酸湯和貴州米酸湯產品的組分發現，混合菌發酵米酸湯的乳酸、酒石酸、總酸、蛋白質、還原糖均高于自然發酵米酸湯，總酸低于貴州米酸湯產品，但(乳酸∶總酸)高于貴州米酸湯產品。電子鼻、電子舌可有效區分不同米酸湯產品的風味特征，作為米酸湯風味分析的一種手段。