糖基化及酶解對大豆蛋白功能性質的影響

楊嘉琪，宋春麗

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)的蛋白質含量可達90%以上，具有良好的營養價值和功能性質，是重要的植物蛋白質來源。當前，大豆分離蛋白作為功能性配料在食品加工中的應用越來越廣泛[1]，這迫切需要開發具有某些更加突出功能性質的大豆蛋白產品。

蛋白質改性技術是提高大豆分離蛋白功能性質的必要手段。蛋白質改性方法很多[2]，糖基化修飾和酶法水解是特別有前景的技術手段[3-4]。蛋白質的功能性質依賴于其相對分子質量、結構和氨基酸組成等[5]。轉谷氨酰胺酶催化的糖基化修飾是一種新型的糖基化修飾手段[6]。該酶不僅可以使蛋白質分子之間發生共價交聯反應，而且能夠催化酰基轉移反應，將氨基糖導入蛋白質側鏈分子中，致使蛋白質的結構發生顯著變化。而酶法水解是在特定pH和溫度的條件下，催化大分子蛋白質的肽鏈斷裂，產生肽甚至是氨基酸[7]。這個過程極大地改變了蛋白質的結構及氨基酸組成。理論上，轉谷氨酰胺酶催化的糖基化修飾和酶解都會改變蛋白質的功能特性。一些研究結果也表明[8]，轉谷氨酰胺酶途徑的糖基化修飾改善了大豆分離蛋白的乳化性。而酶解改善了葵花分離蛋白的乳化穩定性[9]以及大豆分離蛋白的溶解性[10]。一般來說，單一的改性處理效率相對較低，結合不同的修飾方法處理蛋白質能夠提高蛋白質的功能特性[11]。但轉谷氨酰胺酶途徑的糖基化和酶解相結合改造大豆蛋白的功能性質，尚未見有關的研究報告。

本研究首先利用轉谷氨酰胺酶途徑制備糖基化大豆蛋白，隨后利用堿性蛋白酶(Alcalase)酶解制備其水解產物，評估糖基化大豆蛋白的酶解產物的性質變化，包括熱特性及功能性質(溶解性，持水、持油性和乳化性)，揭示糖基化和酶解相結合對大豆蛋白性質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

脫脂豆粉，哈爾濱市賓縣禹王植物蛋白有限公司；轉谷氨酰胺酶，江蘇一鳴精細化工有限公司；殼寡糖(平均分子量為1 kDa，脫乙酰度≥90%)，浙江金殼生物化學有限公司；堿性蛋白酶(2.94×102U/mg)，諾維信公司；大豆油，九三糧油工業集團有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

XW-80A型渦旋混合器，上海青浦滬西儀器廠；T25型均質機，德國IKA公司；UV5100型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；TDZ5-WS型高速離心機，浙江湘儀有限公司；STA 449 F3 Jupiter型熱分析儀，德國Netzsch公司；Nano-ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀，英國Malvern公司。

1.2 方法

1.2.1 糖基化大豆蛋白酶解產物的制備

按照文獻[4]的方法制備糖基化大豆蛋白(glycosylation soyoean protein isolate,GSPI)，隨后以Alcalase為水解用酶，根據pH-Stat法，控制添加的NaOH體積，制得水解度(degree of nydrolysis,DH)分別為1%、2%和4%的酶解產物。具體方法為：配制蛋白質分散液20 g/L，pH 8.5，溫度保持60 ℃，按E/S為1‰(w/w)的比例加入Alcalase，反應過程中通過滴加NaOH溶液維持反應體系的pH為8.5。酶解反應結束后，立刻取出反應產物在85 ℃水浴鍋中滅酶5 min，隨后冷卻至室溫，調節pH為7.5，冷凍干燥，所得修飾產物進行功能性的測定。

1.2.2 熱特性分析

使用STA-449F3型熱重分析儀進行熱特性分析。待測樣品首先在飽和的食鹽水環境中(相對濕度約為75.5%)室溫放置24 h。隨后取5 mg樣品放入氧化鋁坩堝中，氮氣流量為50 mL/min，并且以10 ℃/min的速率在25～140 ℃的溫度條件下測定。

1.2.3 溶解性的測定

配制pH 2～11的緩沖液溶解蛋白質樣品，樣品質量濃度為2 g/L。旋渦30 s后置于4 ℃冰箱過夜，使其充分溶解。次日8 000 g/min離心20 min，收集上清液測定其蛋白質含量。溶解性以蛋白質中可溶性蛋白質含量所占的比例表示[12]。其中，緩沖液的配制方法為：pH 2～3，0.05 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液；pH 4～5，0.05 mol/L的乙酸鹽緩沖液；pH 6～8，0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液；pH 9～11，0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液。

1.2.4 持水性和持油性的測定

參照文獻[13]的方法測定蛋白質的持水性及持油性。稱取0.1 g蛋白質于干燥的離心管中(總質量為W1)，隨后向離心管中加入4 mL蒸餾水，旋渦，至離心管內蛋白質與水充分混合，室溫下靜置30 min，5 000g離心30 min，緩慢倒出上清液，稱量離心后離心管的質量(W2)，持水性按公式(1)計算。

(1)

式中：W0，加入蛋白質干重,g；W1，離心管與干燥的蛋白質質量之和,g；W2，離心后離心管的質量,g。

準確稱量0.1 g蛋白質于離心管中，隨后加入4 mL(V1)精制大豆油，旋渦使樣品與植物油充分接觸，室溫放置30 min后5 000 g/min離心30 min，隨后將上清液移出記錄其體積為V2。見公式(2)。

(2)

式中：W0，加入蛋白質干重,g；V1，加入油的體積，即4 mL；V2，上清液的體積,mL。

1.2.5 乳化性的測定

1.2.5.1 乳化活性和乳化穩定性的測定

用0.1 mol/L(pH 7.5)的磷酸鹽緩沖液溶解待測蛋白質樣品，配制1 g/L的蛋白質分散液，從中取75 mL并與25 mL大豆油混合，12 000 r/min均質1 min，靜置10 min。分別在0 min和10 min時從底部取50 μL乳液加入到5 mL質量濃度為1 g/L的SDS溶液中，混勻，在500 nm處測定吸光值[14]。乳化活性指數(EAI)及乳化穩定性指數(ESI)計算方法見公式(3)和(4)。

(3)

(4)

式中：T=2.303；A0，零時刻的吸光度值；ρ，乳化前蛋白質樣品溶液的質量濃度,g/mL；φ，溶液中油的體積分數；A10，乳液靜置10 min后的吸光度。

1.2.5.2 乳液的平均粒徑和電位的測定

配制1 g/L的蛋白質分散液，與大豆油以體積比1∶3混合，于12 000 r/min均質1 min，4 ℃放置20 h后，稀釋至0.1 mg/mL。隨后用Nano-ZS90型粒度分析儀測定乳液的粒徑和電位[15]。

2 結果與討論

2.1 熱特性

蛋白質的熱穩定性是反映蛋白質結構構象和功能性質的重要指標。本研究分析了大豆分離蛋白及其修飾產物的差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)曲線，結果如圖1所示。從圖1可以看出，在20～140 ℃范圍內，所有的測試樣品都是吸熱反應，對應的SPI、GSPI、GSPI-1%DH、GSPI-2%DH、GSPI-4%DH五種蛋白質熱變性溫度分別為74.6、66.1、65.2、62.5、75.1 ℃。樣品的熱穩定性和熱變性溫度呈正相關，可見經過糖基化修飾的大豆蛋白熱穩定性下降，這與FU等[16]的研究結果一致。而糖基化大豆蛋白經過Alcalase酶解后得到的產物(水解度為1%～4%)的熱穩定性先下降后增加。焓變ΔH和蛋白質的有序程度有關[17]。相比于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白的ΔH顯著增高，可能是由于糖基化修飾使蛋白質的結構更緊密，而水解產物的ΔH隨著水解度的增大而減小，原因可能是酶解使蛋白質形成小分子肽，降低了蛋白質的有序結構。

2.2 溶解性

不同pH條件下的大豆蛋白及其修飾產物的溶解性如圖2所示。

從圖2可以看出，在pH值2～11范圍內，大豆分離蛋白的糖基化產物的溶解性下降。雖然糖基的導入有利于提高蛋白質的溶解性[18]，但是在糖基化修飾過程中蛋白質分子內/間的交聯反應與糖基的導入共同發生，交聯修飾導致大豆蛋白聚集生成大分子聚合物[19]。相對于大豆蛋白，糖基化大豆蛋白的酶解產物的溶解性顯著提高，并且隨著水解度的增大而增大。在等電點(pH 4.5)處，水解度為4%的糖基化大豆分離蛋白(GSPI-4%DH)溶解性提高了54.0%，在中性pH 7.0處的溶解性提高了43.9%。酶解使蛋白質釋放小分子肽，從而提高了蛋白質的柔韌性[11]。ZHANG等[20]的實驗結果表明，限制性酶解提高了大豆分離蛋白-麥芽糊精交聯產物的溶解性。結果表明，糖基化修飾降低了大豆蛋白的溶解性，而隨后的限制性酶解顯著地提高了蛋白質的溶解性，這有利于擴大大豆蛋白在酸性及中性食品的應用。

2.3 持水性和持油性

蛋白質的持水性和持油性在食品加工和保藏過程中十分重要。大豆分離蛋白及修飾產物的持水性和持油性的結果如圖3所示。

從圖3可以看出，相對于大豆分離蛋白，糖基化產物的持水性提高了11.7%，可能是由于蛋白質與糖發生了共價交聯反應，而導入的殼寡糖中含親水性糖基，使蛋白質的持水能力增加。而水解產物的持水性隨著水解度的增大逐漸變小，分別降低了86.7%、88.3%和97.1%。原因可能是蛋白質經酶解后肽鍵斷裂，形成小分子肽，不利于網狀結構的形成，從而持水性下降[21]。此外可以看出，相比于大豆分離蛋白，改性后蛋白質的持油性顯著增強。糖基化和水解使蛋白質內部的疏水基團暴露，有利于提高產物的持油能力[22]。

2.4 乳化性

2.4.1 乳化活性及乳化穩定性

大豆分離蛋白及其修飾產物的乳化活性及乳化穩定性分析結果如圖4所示。從圖4可以看出，糖基化大豆蛋白的乳化活性最低，但是具有較高的乳化穩定性。經Alcalase酶解后，產物的乳化活性提高，水解度為2%和4%的糖基化產物的乳化活性顯著提高(高于大豆蛋白)，但是乳化穩定性下降，此時的乳化穩定性為大豆蛋白的79.6%和76.3%。水解物中肽的相對分子質量降低，在界面處不能穩定吸附，所以乳液發生聚集，乳化穩定性下降[23]。

2.4.2 乳液的平均粒徑電位

乳液的平均粒徑、電位與蛋白質的乳化活性直接相關[24]，分析乳液的平均粒徑和電位對深入剖析蛋白質的乳化性有一定的意義。乳化平均粒徑和電位分析結果見圖5。

相比于大豆蛋白(130.9 nm)，糖基化修飾產物的乳液平均粒徑最大(153.5 nm)，而其酶解產物的乳液平均粒徑減小(1%～4%DH 的GSPI分別為150.7、135.2、116.5 nm)，而且隨著水解度的增大逐漸減小(圖5)。這是因為酶解后的蛋白質疏水基團暴露，隨著疏水基團的增加，在均質過程中，蛋白質能更快吸附到油水界面，將油滴包裹起來，阻止液滴聚集，因而使乳液的平均粒徑變小。酶解后蛋白質的分子體積變小也是其中一個原因。HEMAR等[25]研究發現，乳液的平均粒徑和乳化活性呈負相關，即乳液平均粒徑越小，乳化活性越大。這與本實驗的研究結果一致。

除此之外，電位的變化也一定程度上與乳液的穩定性相關。本研究分析的電位絕對值變化為：糖基化大豆蛋白>大豆蛋白>糖基化大豆蛋白水解物(GSPI-4%DH 除外)。高電位值表明液滴間的斥力大，乳液的穩定性增強[26]。因而GSPI具有較高的乳化穩定性，而水解物表現為較低的乳化穩定性，這與比濁法分析結果一致(圖4)；但是，以其水解物制備的乳液電位先下降后增加(1%～4%DH 的GSPI分別為-22.9、-15.3、-29.9 mV)，這與乳化穩定性的分析結果不一致。而GSPI-4%DH雖然具有較高的電位，但是其乳化平均粒徑下降，在界面處不能穩定吸附，所以乳液發生聚集，乳化穩定性下降[24]。

3 結論

轉谷氨酰胺酶途徑的糖基化及隨后的酶解修飾相結合能夠改變大豆分離蛋白的功能性質。糖基化大豆蛋白在低水解度(1%～4%)時，就能夠顯著地改善糖基化大豆蛋白的一些功能性質。在水解度為4%時，溶解性增加(等電點pH 4.5和中性pH 7.0條件下分別提高了54.0%和43.9%)；乳化活性和持油性分別增加了19.5%和35.4%。因而結合糖基化和酶解修飾，能夠制備出具有理想功能性質的食品功能性配料。