以淘汰蛋雞為原料利用蛋白酶解技術制備咸味增強肽

陳瑞霞，孫思遠，相悅，孫承鋒*，孫為正

1(煙臺大學，山東 煙臺，264005) 2(華南理工大學，廣東 廣州，510641)

食鹽作為使用最廣泛的調味品，在人們的日常生活中發揮著重要作用。例如賦予食品咸味并改善整體風味,降低食物中的水分活度從而達到防腐抗菌作用，延長食品貨架期以及調節人體代謝平衡等[1]。但是，食鹽攝入量過高會增加高血壓、心血管疾病的發病率[2]。目前，我國人均食鹽攝入量(12 g/d)遠高于WHO所推薦的攝入量(5 g/d)[3]。隨著消費者對健康飲食的日益關注，開發兼具營養價值的低鈉調味品對食品行業的發展尤為重要。

TADA等[4]在酪蛋白水解物的N-端類似物合成過程中偶然發現，Orn-β-Ala HCl和Orn- Tau HCl具有與NaCl相似的咸味，這是咸味肽首次被發現。此后，大量研究表明，蛋白質水解物具有咸味或咸味增強作用，但大多集中于海洋資源蛋白質深加工利用方面。ALEXANDER等[5]研究發現，魚精蛋白酶解產物經分離純化得到的精酰胺二肽具有咸味增強作用。王欣等[6]發現，雙酶酶解哈氏仿對蝦蛋白可將其酶解產物的感官咸味強度從10 mmol/L NaCl提高至55 mmol/L NaCl。

淘汰蛋雞肉質老化、加工性能差，但是其雞肉依然具有低脂肪、高蛋白，產量大，價格便宜等優點[7]。利用蛋白酶解技術對雞肉進行加工可以有效提高淘汰蛋雞的附加價值[8]。木瓜蛋白酶作用于肽鏈末端的賴氨酸和精氨酸[6]，以賦予雞肉蛋白酶解物獨特的風味尤其咸味[9]。因此，本文以淘汰蛋雞為原料，采用木瓜蛋白酶制備咸味增強肽，為咸味肽的進一步開發利用提供方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

三黃雞,廣東溫氏食品集團股份有限公司提供，將雞肉剔骨、去皮、去除脂肪后用絞肉機絞成肉糜，分裝置于-20 ℃貯藏備用;木瓜蛋白酶,廣州裕立寶生物科技有限公司；食鹽，四川樂山聯峰鹽化有限責任公司。

1.1.2 儀器設備

MM12型絞肉機，廣東省韶關市大金食品機械廠；SHA-C型水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市農儀器廠；CEM MARS 5型高壓高通量微波消解系統，美國CEM公司；3-18K型高速冷凍離心機，廣州倍立思儀器有限公司；KND-103F型凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；916Ti-Touch型全自動電位滴定儀，瑞士萬通中國有限公司；Z-2000型原子吸收光譜儀，日本日立公司；TS-5000Z型電子舌，日本Insent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞肉蛋白酶解

稱取20 g雞肉肉糜，加入去離子水以及木瓜蛋白酶，勻漿，置于恒溫水浴鍋中酶解，酶解完成后沸水浴滅酶20 min，冷卻至室溫,離心20 min(4800×g，4 ℃)，過濾，所得濾液為酶解產物。

1.2.2 蛋白回收率測定

根據GB 5009.4—2016[10]中的凱氏定氮法測定其粗蛋白含量，蛋白回收率計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.3 水解度測定

采用甲醛電位滴定法測定其游離氨基酸含氮量[11]，并計算其水解度：

(2)

1.2.4 鈉離子含量測定

酶解液經微波消解后，參照GB 5009.91—2017[12]，采用火焰原子吸收法測定其Na+含量。

1.2.5 感官評定

1.2.5.1 咸味評價

經過篩選和培訓，選擇12名學生(5名男性，7名女性)組成感官評價小組，評價雞肉蛋白酶解物的咸味。咸味評分采用5分制(0表示沒有咸味，3表示咸味適中，5表示咸味強烈)。感官評定實驗在室溫下進行，感官評價人員每次取1 mL樣品進行評價，品嘗完立即用清水漱口，每個樣品間隔1 min。以感官評分的平均值作為最終咸味得分。

1.2.5.2 咸味強度評定方法

參照GB/T 19547—2004[13]，采用量值估計法評定酶解物的咸味強度。通過評估幾何圖形的面積引導評定人員掌握量值估計法的基本概念；配制0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mmol/L系列梯度的NaCl溶液，感官評定人員品嘗系列梯度濃度的NaCl溶液以了解不同濃度NaCl溶液的咸味強度[14]。將所有樣品的Na+含量調整至50 mmol/L，評定人員以50 mmol/L NaCl溶液作為外部參比樣給出待測樣品的具體咸味強度值(mmol/L NaCl)。進行感官評定實驗前1 h，感官評定人員不可食用其他有刺激性味道的食物和飲料，不可過于疲勞。待測樣品采用3個隨機組合數字進行編號，評定人員只評定樣品溶液的咸味強度，不考慮其他的味道[15]。

1.2.6 電子舌評定

味覺信號采用日本Insent公司的TS—5000Z味覺分析系統進行檢測。基本原理是AAE、CT0、C00三個味覺傳感器分別與呈味物質相互作用引起人工脂膜膜電勢的變化，并將該電勢作為傳感器的輸出信號傳輸到電腦進行分析，以此評價樣品的鮮味、咸味、苦味3種基本味道[16]。鮮味傳感器AAE反映樣品的鮮味和濃厚味，咸味傳感器CT0反映樣品的咸味，苦味傳感器C00反映樣品的苦味和苦味回味[16]。味覺傳感器和參比電極使用前需要活化以保證數據的穩定性。以50 mmol/L NaCl溶液為參照液，對樣品進行電子舌分析，每個樣品測試4次。

1.2.7 單因素實驗

以酶解時間、溫度、加酶量和肉水比為實驗因素，進行單因素實驗研究木瓜蛋白酶的酶解特性，水解度、蛋白回收率和酶解產物的咸味評分為指標篩選酶解條件。

1.2.8 正交實驗

根據單因素實驗結果，選取酶解時間、肉水比、加酶量為實驗因素按L27(37)進行正交優化實驗。通過正交實驗分析3種因素之間的交互作用，并以水解度和咸味強度(mmol/L NaCl)為實驗指標確定最優酶解條件。

1.2.9 數據分析

使用SPSS 17.0統計軟件進行處理分析，One-way ANOVA分析顯著性(P<0.05)；采用Excel 2010和Origin 2016繪制圖表。

2 結果與討論

2.1 酶解時間對雞肉酶解產物的影響

如圖1所示，蛋白回收率隨酶解時間延長而逐漸增加；其中2～4 h蛋白回收率增速最大，隨后呈緩慢增加趨勢。DONG等[17]采用風味蛋白酶酶解雞骨架時也得到類似結果。其原因為反應開始時，體系中酶和底物充足使大分子蛋白質含量迅速增加；之后，大分子肽段裂解成更小的肽段和游離氨基酸[18]。2～10 h內水解度顯著增加(P<0.05)；說明易被酶解的肽段還未完全裂解且酶充足[17]。酶解產物的咸味主要與氨基酸和小分子肽相關[19-20]，酶解過程中小分子物質種類和含量的變化引起咸味的改變。酶解產物的咸味評分在4和8 h時最佳，其可能與含有較多的與咸味相關的小分子物質相關。因此，經綜合考慮，后續實驗選取酶解時間為8 h。

2.2 酶解溫度對雞肉酶解產物的影響

如圖2所示，40～60 ℃范圍內，蛋白回收率和水解度均先增后減；溫度過高可能引起木瓜蛋白酶熱變性，酶活性降低[8,21]。50 ℃時蛋白回收率(72.96%)和水解度(21.18%)均達最大；由此可見，該體系下木瓜蛋白酶的最適酶解溫度為50 ℃。李超等[9]研究雞肉蛋白酶解條件和酶解產物降解規律時也有相似的結果。雞肉酶解產物的咸味評分隨溫度升高呈先降后升再降再升的趨勢，在50 ℃達最大。因此，選擇50 ℃作為后續酶解實驗的酶解溫度。

2.3 加酶量對雞肉酶解產物的影響

如圖3所示，加酶量0.15%～0.30%(w/w)時，蛋白回收率和水解度隨加酶量增加而增加，但均無顯著性差異(P>0.05)；由于酶濃度增加造成蛋白酶無法與底物有效結合，限制酶解反應速率[21]。加酶量低于0.20%(w/w)時樣品之間的咸味評分沒有顯著性差異(P>0.05)，高于0.2%(w/w)時顯著降低(P<0.05)。因此，綜合考慮選擇0.2%(質量分數)加酶量進行下步實驗。

2.4 肉水比對雞肉酶解產物的影響

如圖4所示，蛋白回收率和水解度均隨肉水比增加而顯著提高(P<0.05)；其原因是肉水比增加，酶解反應體系中水增加，肉糜與酶接觸更充分，酶解產生更多的小分子肽和氨基酸[7]。李超等[9]發現肉水比對水解度影響不大，這可能是雞肉品種和酶解條件不同造成的。肉水比超過1∶2(w/w)之后，酶解產物的咸味評分顯著下降(P<0.05)。因此，選擇肉水比為1∶2(w/w)。

2.5 正交優化實驗結果分析

如表2所示，由極差R可得出因素A(時間)對水解度和咸味增強作用的影響均位于第一位，本文主要為獲取咸味增強作用最佳的酶解產物，最終選擇A1；對于因素B(加酶量)，其對水解度和酶解產物咸味增強作用的影響均為次要因素，此時選取B3；因素C(肉水比)對水解度的影響排第二位，此時選C3；因素C與因素B的交互作用對咸味增強作用的影響排在第二位，此時選C2；結合本實驗是以獲得咸味增強作用最佳的雞肉酶解產物為主要目的，則取C2。因此最優組合為A1B3C2，即酶解時間4 h，加酶量0.2%(質量分數)，m(肉)∶m(水)為1∶2；該條件下制備的酶解物能夠將50 mmol/L NaCl溶液的咸味感知強度提升至63.1 mmol/L NaCl，咸味強度增加了26.2%。其原因是該條件酶解制備的雞肉酶解物中本身帶有咸味或具有咸味增強作用的小分子肽和游離氨基酸含量較高[9]。有研究報道，含3.0%(質量濃度)魚精蛋白酶解產物的肉湯模型可以使50 mmol/L NaCl溶液的咸味增加，經分離純化后發現一系列含精氨酸的二肽均具有咸味增強作用[5]。

方差分析結果如表3所示，酶解時間、加酶量、肉水比對水解度均具有顯著性影響(P<0.05)；酶解時間和加酶量之間存在交互作用且對水解度有顯著性影響(P<0.05)。對雞肉酶解產物的咸味增強作用有顯著性影響(P<0.05)的只有酶解時間。

注：“*”表示顯著性差異。

2.6 電子舌結果分析

對酶解產物咸味、鮮味、苦味、苦味回味和濃厚味電子舌輸出信號值進行主成分分析的結果如圖5所示，2個主成分可以解釋78.79 %的原始變量信息，說明PC1和PC2能充分解釋27組樣品的味道信息。正交實驗的27組雞肉蛋白酶解產物分布在4個象限內，說明電子舌可以較好區分不同酶解產物味道的差異。CHEUNG等[22]研究蝦副產品酶解產物的味道時，也發現通過對電子舌輸出結果進行主成分分析可以將樣品分類。劉樹萍[23]利用電子舌和電子鼻研究排骨湯風味變化，同樣發現電子舌可以較好地區分9組樣品的滋味差異。

不同酶解時間處理組的樣品組間間距大；相同酶解時間下的樣品組內距離小；這表明酶解產物的味道與酶解時間相關，且時間對酶解產物味道的影響較大；加酶量和肉水比對酶解產物味道的影響較小，這與感官分析結果基本一致。李微等[24]也發現大黃魚酶解產物的感官評分和電子舌結果具有一致性。有文獻報道，以人工脂膜為基礎的味覺傳感器具有整體選擇性，其輸出結果與人類感官評分具有良好的相關性，可以廣泛應用于很多領域，比如藥品和飲料[16]。

3 結論

木瓜蛋白酶酶解雞肉蛋白制備咸味肽的最佳酶解條件為：時間4 h，溫度50 ℃，加酶量0.2%(質量分數)，m(肉)∶m(水)為1∶2；影響酶解產物咸味增強作用的主要因素是酶解時間。在此條件下酶解制備的酶解產物咸味增強作用較佳，能夠將50 mmol/L NaCl溶液的咸味感知強度提升26.2%，且富含多肽和游離氨基酸兼具較高的營養價值，可用于開發具有調味和營養價值的功能性調味品。電子舌主成分分析結果表明，27組正交實驗樣品分布在4個象限，相同酶解時間下的酶解產物的味道具有一定相似性，酶解時間對樣品味道的影響最大。電子舌可以用來區分不同酶解條件下制備的酶解產物的味道差異，為客觀評價蛋白酶解產物的味道提供了理論依據。