直投式發酵劑菌株篩選及發酵特性

魏光強，王雪峰,2*，陳 越，楊許梅，趙存朝，黃艾祥

1(云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明，650201) 2(云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南 昆明，650201) 3(云南省農業科學院 生物技術與種質資源研究所，云南 昆明，650223)

發酵乳因其具有豐富的營養和良好的保健功能[1-2]，越來越受到消費者的青睞，市場需求量的快速增長也要求相應發酵劑的穩定和豐富化[3]。發酵劑的發酵特性包括迅速產酸、產黏和產香等特性[4]，但單一菌株難以達到以上特性，為此需通過添加增稠劑、穩定劑及食用香精等添加劑提高產品質量，但這會增加了生產成本，加大食品的安全風險[5]。因此，對菌種的選擇、菌株的優化搭配和發酵劑的制備提出了更高的要求，將不同發酵特性的優良菌株進行組合有利于提升發酵劑的整體性能，也是生產優質發酵乳的關鍵環節。

弓耀忠[6]將產乳酸菌胞外多糖菌株Lvan04、產Nisin菌株LA02、嗜熱鏈球菌1和保加利亞乳桿菌2組成復合發酵劑，提高了發酵乳的黏度、穩定性及口感；REZA等[7]研究發現嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌和瑞士乳桿菌復合發酵劑發酵的酸奶具有良好外觀和令人愉快的酸性香氣，且發酵乳中胞外多糖較少；穆明道等[8]研究發現球桿菌1∶1(體積比)復合菌的產酸能力、凝乳效果比單菌株高，后酸化偏弱且趨于穩定。有鑒于此，本研究以前期從云南特色發酵食品中分離鑒定的12株乳酸菌為出發菌株，從中篩選出多種具有較強產黏和產香特性的菌株進行互配制備直投式發酵劑(directed vat set,DVS)，以pH、黏度、持水率、活菌數、產香成分為評價指標，確定最佳的菌株組合并綜合評價其發酵性能，旨在為開發出一種產黏性、產香性好和后酸化現象平緩的DVS提供科學依據，進一步提高發酵乳產品的穩定性和風味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料乳

鮮牛乳,云南昆明奶牛牧場。

1.1.2 菌種

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、類干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、德式保加利亞乳桿菌亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)，均從云南特色發酵食品乳餅、乳扇、酸水中分離鑒定，于云南農業大學食品科學技術學院保藏。菌株使用前進行活化，4 ℃冰箱儲存備用。商業直投式酸奶發酵劑1、2、3，科漢森(北京)貿易有限公司。

1.1.3 試劑

MRS肉湯培養基、MRS固體培養基，廣州環凱微生物科技有限公司；雙乙酰標準溶液,上海源葉生物科技有限公司；NaOH、TCA、C6H4(NH2)2、NaHCO3、NaHSO3、HCl，均為分析純，天津市鳳船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-6100S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；TGL20M型高速冷凍離心機，長沙邁佳森儀器設備有限公司；SVJ-358型智能商用酸奶機，北京世紀陽光有限公司；NDJ-4型旋轉黏度計，武漢格萊莫檢測設備有限公司；雷磁PHSJ-4A型pH計，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 直投式發酵劑菌種篩選

以pH、酸度、黏度、持水率、活菌數、組織狀態、凝乳時間為指標，從云南特色發酵食品中分離鑒定的12株乳酸菌中篩選出具有較強發酵性能的乳酸菌制備DVS。

1.3.2 DVS菌種復配

經篩選，嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、類干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌亞種5株菌具有良好的發酵特性，其中羅伊氏乳桿菌具有良好的產黏特性，嗜酸乳桿菌具有良好的產乙醛能力。故以羅伊氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌為核心菌株，進行復合菌種組合試驗，根據發酵性能確定最佳的發酵乳菌種組合。菌種組合設計如下表1所示。

1.3.3 直投式發酵劑的制備

本研究采取真空冷凍干燥技術(1.5～3 MPa，-50 ℃)對發酵劑進行冷凍干燥，為降低真空冷凍干燥過程對菌種的影響，實驗用2%(體積分數)的甘油、8 g/L的葡萄糖和20 g/L的抗壞血酸添加到牛乳培養基中進行冷凍干燥。

1.3.4 發酵乳加工工藝流程

原料乳(驗收，冷貯)→配料→預熱(50～60 ℃)→均質(8～10 MPa均質)→滅菌(巴氏殺菌85 ℃,15 min)→冷卻(30～45 ℃)→接種(接種量0.2%，體積分數)→發酵(38～42 ℃，10 h)→冷藏后熟(2～4 ℃)

1.3.5 DVS發酵性能分析

1.3.5.1 發酵劑產酸能力測定

pH值的測定，采用pH計直接測定。

1.3.5.2 發酵乳后酸化程度測定

酸度測定，參照《食品安全國家標準 食品酸度的測定》(GB/T 5009.239—2016)提供的酸堿滴定法進行測定。

1.3.5.3 發酵劑產黏能力測定

黏度測定，采用NDJ-4型旋轉黏度計直接測定；持水力測定，參照HASSAN的方法測定。

1.3.5.4 發酵劑活菌數測定

參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》(GB 4789.35—2016)進行測定。

1.3.5.5 發酵劑產香能力測定

(1)產乙醛能力測定

參照劉寧寧等[9]的方法進行測定。取8%(質量濃度)的三氯乙酸(trichloroacetic,TCA)溶液與樣品以1∶1(體積比)的比例混勻，充分搖勻，以4 500 r/min離心10 min(4 ℃)，上清液通過濾紙過濾，取5 mL加入1.00 mL NaHSO3溶液中混勻，室溫下靜置1 h，反應完成后加入0.5 mL 1%(質量濃度)淀粉溶液，滴入0.1 mol/L碘液，快到終點時換用0.01 mol/L碘液，到溶液剛好為淺藍色，靜置30 s不變色，就是初滴定終點，不進行讀數。隨后加10 mL 1 mol/L NaHCO3，振蕩使溶液藍色完全褪去，最后用0.01 mol/L碘標準溶液滴定至剛好呈藍色且30 s不變色，記錄消耗標準碘液的體積，同時做對比實驗。

(2)產雙乙酰能力測定

參照呂嘉櫪等[10]的方法進行測定。取8%(質量濃度)的TCA溶液與樣品1∶1(體積比)混合，充分搖勻，于4 500 r/min離心10 min(4 ℃)，將上層液體用濾紙過濾量取10 mL，加入0.5 mL 1%(質量濃度)鄰苯二胺溶液，搖勻后放于黑暗處放置30 min。待反應完全后，標準溶液中加入2 mL 4.0 mol/L HCl結束反應。以雙乙酰為標準品，繪制標準曲線回歸方程為：y=0.082 4x-0.031 9(R2=0.999)；y為吸光度，x為雙乙酰濃度。以純牛奶作為空白對照，于335 nm波長下測定其吸光度。

1.3.6 發酵乳感官評價

待乳發酵結束后取出，于4 ℃條件下貯藏24 h后由受過專業訓練的8位品評員進行品評，他們完全理解感官特性，熟知發酵乳的評價標準。分別對樣品的組織狀態、色澤、黏稠度、酸甜比、奶香味與發酵乳風味6個方面對酸奶進行感官評價，各感官評價指標和相應的標準如下表2所示。

1.4 數據統計分析

每個樣品至少3次重復數據，結果以平均值(AV)±標準差(SD)表示，通過SPSS 17.0軟件進行方差顯著性分析，P<0.05時表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 DVS菌株的篩選

乳酸菌的產酸、產黏及產香能力是選擇發酵劑的主要指標，產酸能力強、發酵時間短[11]，產黏性強，形成的酸奶質構指標相對比較高[12]，產香能力強則能賦予發酵乳濃郁的香味。從表2可以看出，嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、類干酪乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌亞種、嗜熱鏈球菌5株菌的發酵乳酸度值均在 65～100 °T之間，pH值在4.2～4.35之間，均具有良好的發酵產酸性能；發酵乳持水率和黏度值顯著高于其余菌株(P<0.05)，其中羅伊斯乳桿菌的發酵產黏性最好；其中嗜酸乳桿菌產乙醛能力最強，發酵乳乙醛含量較高。5株乳酸菌具有良好的發酵特性和產黏產香性，且發酵乳中乳酸菌活菌都符合標準，可用于DVS的制備。

注：同一行上標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 不同菌種組合發酵性能的比較分析

2.2.1 不同菌種組合發酵產酸能力測定

pH值和發酵乳的風味和組織結構密切相關，是決定發酵乳產品最終質量好壞的主要因素，pH值的變化能反應出菌株產酸能力，所以測定菌種組合發酵過程中pH值變化顯得尤為重要。從圖1中可以看出，4組菌種組合的pH值從最初的6.78降到了4.2～4.6之間，其主要原因是乳酸菌在發酵過程中將乳糖代謝成乳酸，pH值降低[13]。其中，D組合的pH下降最快，產酸能力最強，發酵8 h后的pH值為4.21，其次是組合B、C、A，不同菌種組合所含的乳酸菌菌株不同或菌種混合比例不同，引起其產酸能力的不同，導致發酵乳pH的變化具有一定的差異[14-15]。

2.2.2 不同菌種組合發酵過程中活菌數變化

發酵乳發酵過程中，乳酸菌的生長繁殖產生的代謝產物會引起發酵乳發生一系列變化，乳酸菌活菌數直接影響著發酵乳的風味[16]。由圖2可以看出，在發酵0～4 h時乳酸菌數量迅速增多，原因是發酵階段的溫度在40 ℃左右，為乳酸菌最適生長溫度，在發酵后期乳酸菌數量緩慢增長，說明4個菌種組合的發酵劑中乳酸菌相互促進了生長。當發酵8 h時，對比4個菌種組合在發酵乳中的乳酸菌數量，D組合的乳酸菌數量最高，發酵至8 h時達到了8.2×107CFU/mL，其次是C、B、A組合。D組合的活菌數總體在發酵期間平穩增長，菌株之間的相互協調作用能力更強。

2.2.3 不同菌種組合發酵乳后酸化現象測定

酸度與發酵乳的風味和品質密切相關，如果發酵乳酸度過高，在貯藏過程中會造成發酵乳乳清析出，導致其風味、感官質量下降[16]。根據圖3顯示，隨著冷藏時間的延長，發酵乳酸度越來越高，原因是乳酸菌的生長繁殖消耗剩余的乳糖產生乳酸，產生后酸化現象。在冷藏5 d內，4種菌種組合生產的發酵乳滴定酸度快速增長，冷藏10～15 d時增長比較緩慢，原因是冷藏初期乳酸菌數量較高，消耗乳糖產酸量也越高，隨著冷藏時間的延長乳酸菌數量開始下降，后酸化現象也開始減弱[17]。在15～20 d時A組合和B組合發酵乳的酸度迅速增長，出現嚴重后酸化現象，酸度過高，影響酸奶的品質與風味。C組合和D組合發酵乳的酸度變化趨勢平緩，冷藏20 d內發酵乳的酸度值保持在90～100 °T之間。

2.2.4 不同菌種組合發酵乳在冷藏過程中乙醛、雙乙酰含量變化

發酵乳中乙醛和雙乙酰一直被認為是風味的主要成分。其中，乙醛是發酵乳中最具代表性的芳香物質，高濃度的乙醛是形成發酵乳良好風味的重要前提；雙乙酰是發酵乳中重要的產香物質，能賦予發酵乳良好的奶油香味，微量存在就會使發酵乳的風味得到很大的提高[18-19]。發酵劑中菌種種類、菌株比例和活力對發酵乳中風味物質含量起著關鍵性的作用[20]。

由圖4可以看出，4種菌種組合在發酵終點時發酵乳中乙醛含量最高的是A組合，為7.98 μg/mL，其次為C、D、B組合。在冷藏0～5 d內，不同菌種組合發酵乳中乙醛含量有不同程度的增加，其中B組合增加的幅度最大，其次是D組合，第5天時D組合的乙醛含量最高，為9.34 μg/mL。在5～20 d之間乙醛含量開始不斷降低，下降最快的為B組合，原因是在貯藏期乙醛具有揮發性，當貯藏條件不當時會有損失，同時生產的乙醛有可能作為中間產物在乙醛還原酶的催化作用下被還原成乙醇，從而降低發酵乳中風味物質的含量[21]。

由圖5可以看出，4種菌種組合在發酵終點時發酵乳中雙乙酰含量最高的是D組合，含量為9.36 μg/mL，其次為C、A、B組合。在冷藏0～5 d時，A、B、C和D組合的雙乙酰含量均呈現上升趨勢，可能的原因是乳酸菌繼續利用乳糖、檸檬酸生成丙酮酸，再合成雙乙酰，導致雙乙酰含量增加[18]；在第5天時雙乙酰含量最高為D組合，達到11.63 μg/mL。在冷藏5～20 d時，4個組合發酵乳的雙乙酰含量總體呈下降的趨勢，直到冷藏20 d時，D組合的雙乙酰含量是最高的，達到6.67 μg/mL，其次是C、A、B組合。總體來說，D組合菌株具有很好的產香特性，發酵的發酵乳在貯藏0～20 d內乙醛和雙乙酰含量較高，能賦予發酵乳良好的奶油香味，使發酵乳風味得到提高。

2.3 發酵劑發酵性能綜合評價

實驗以產黏、產香、貯藏期后酸化平緩為指標，篩選出最佳菌種組合D，即嗜酸鏈球菌、嗜熱乳桿菌、類干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌，菌種互配比例為1∶2∶1∶2∶1(體積比)。為進一步證明D組合的良好發酵性能，把D組合DVS與3種商業直投式酸奶發酵劑進行發酵性能及感官評價比較。

2.3.1 發酵性能對比

由表4可以看出，菌種組合D發酵的發酵乳中活菌數為8.2×107CFU/mL，黏度值為8 800 mPa·s，持水率為86.35%，均高于3種商業直投式酸奶發酵劑發酵的酸奶(P<0.05)，提高了發酵乳的黏性。此外，發酵乳pH和酸度適中，乙醛含量達到7.51 μg/mL，高于2號商業直投式酸奶發酵劑生產的發酵乳。

2.3.2 感官評價

分別從組織狀態、色澤、黏稠度、酸甜比、奶香味與酸奶風味6個方面對發酵乳進行感官評價，結果如圖6所示。4種發酵乳的綜合感官評分中以本實驗研究得到的發酵劑生產的發酵乳綜合評價最高，特別是奶香味和黏度值評分均高于其他3種發酵劑生產的酸奶，酸甜比、色澤、酸奶風味與商業直投式酸奶沒有太大的差別。發酵乳中的雙乙酰賦予了發酵乳獨特的奶香味，較高的黏度值賦予了發酵乳較好的組織狀態和良好的口感。

3 結論

為提高發酵乳的黏度和風味，改善發酵乳口感及后酸化現象，本試驗以酸度、pH、持水率、黏度、組織狀態及凝乳時間、活菌數為評價指標，從12株云南特色發酵食品分離鑒定的乳酸菌中篩選出5株具有較強發酵性能、食用安全的菌種，即嗜酸鏈球菌、嗜熱乳桿菌、類干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德式保加利亞乳桿菌亞種；當其按1∶2∶1∶2∶1(體積比)的菌株配比制成DVS時表現出良好的發酵性能，此時發酵乳中酸度、黏度、活菌數以及乙醛和雙乙酰含量分別為98.12 °T、8 800 mPa·s、8.2×107CFU/mL、7.51 μg/mL和9.36 μg/mL；與3種商業直投式酸奶發酵劑相比，該發酵劑生產的發酵乳酸度適宜、產黏性更好、產香能力適中且后酸化現象不明顯，總體感官評分值高，有望成為一種新的DVS應用于發酵乳生產，后續將進一步對該發酵劑進行發酵乳的中試化生產。