排酸牛肉的品質變化規律及其烹煮時機的優選

王恒鵬，王引蘭，吳鵬，陳勝姝，屠明亮，高子武，孟祥忍*

1(揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州,225100) 2(江蘇省淮揚菜產業化工程中心，江蘇 揚州,225100) 3(江蘇旅游職業學院 烹飪科技學院，江蘇 揚州，225127)

西門塔爾牛原產于瑞士阿爾卑斯山西北部的山谷地帶，該品種產奶、產肉、役用與適應性能均較出眾，由于遺傳性強，許多國家都有引進西門塔爾牛在本國培育，并以該國國名命名[1]。中國西門塔爾牛因具有良好的適應性，近年來得到大面積推廣與使用，已成為肉牛業的主導品種之一，市場需求量穩中有升，具有良好的行業前景。

肉牛宰后會發生一系列物理化學變化，主要包括肌肉僵直、成熟、自溶、腐敗4個階段[2]。其中達到僵直期的肌肉在進行加熱時肉質變硬、保水性差，此階段的肉不適宜用于烹調加工。當肌肉僵直達到最大程度并維持一段時間后，開始緩慢解僵，肌肉嫩度、保水能力及風味會得到較大改善[3]，此時的肌肉進入宰后成熟期，處于僵直期和成熟期的畜肉均為新鮮肉。成熟期過后，肌肉進入自溶階段，自溶為細菌的侵入、繁殖創造了條件，隨后肌肉中的蛋白質、含氮物質分解，pH值上升，肌肉發生腐敗變質，逐漸失去食用價值[4]。

排酸是提高牛肉品質的有效手段[5]，排酸過程中肉類原料的品質變化機理也是當下的研究熱點之一。排酸牛肉又稱冷卻排酸牛肉，低溫排酸(0～4 ℃)可使牛肉經歷較為充分的解僵和成熟過程，既可保證肉質細嫩、鮮美，又能有效抑制微生物的生長繁殖，是生產高品質、低風險牛肉的重要工藝[6]。本試驗對排酸期間的西門塔爾牛背最長肌的部分新鮮度指標與品質指標進行了測定，探究了排酸期間牛肉的品質變化規律，同時根據其品質變化情況選擇牛肉適宜的烹煮時機，以期為高品質牛肉的生產與后期的烹煮加工提供全面的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集6頭12月齡，飼養條件一致的中國西門塔爾公牛，由無錫天鵬集團有限公司提供，宰前禁食禁水。

硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、無水乙醇、乙醚、石油醚、濃鹽酸均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；2-硫代巴比妥酸為分析純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

BS210S(1/10000)分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；HH-S6型數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市科析儀器有限公司；BPH-9082精密恒溫培養箱，上海巴玖實業有限公司；721型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；DSC 204 F1 phoenix?型差示掃描量熱儀，德國耐馳公司；C-LM2型肌肉嫩度儀，北京朋利馳科技有限公司；K1100F型全自動凱氏定氮儀，上海固呈科學儀器有限公司；HTG型立式鼓風干燥箱，上海精密儀器有限公司；RH-1000型肉品系水力測定儀，廣州潤湖儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

按照GB/T 19477—2018《畜禽屠宰操作規程》進行屠宰[7]，在胴體12～13肋骨處取背最長肌肉樣，置4 ℃排酸庫中進行排酸處理，記錄時間，在排酸12、24、48、72、120、168 h進行取樣測定。

1.3.2 細菌總數測定

參照GB 4789.2—2016進行菌落總數的測定[8]，取25 g排酸牛肉樣品，加入225 mL無菌生理鹽水進行均質，以10倍稀釋度將牛肉漿稀釋，取3個濃度合適的稀釋液0.1 mL，涂布于營養瓊脂培養基表面，每個稀釋液涂布3個平皿，于37 ℃恒溫培養箱中培養2 h。

1.3.3 TVB-N值測定

參照GB 5009.228—2016進行排酸牛肉樣品的揮發性鹽基氮測定[9]。

1.3.4 TBARS值測定

取不同排酸時間的牛肉樣品10.0 g，切碎，加50 mL蒸餾水，浸泡2 min后用47.5 mL水沖洗移入蒸餾燒瓶中，加2.5 mL 4 mol/L的鹽酸，調節pH至1.5，加入少量消泡劑和玻璃珠，加熱蒸餾。沸騰10 min后開始收集50 mL蒸餾物，用移液管移取5 mL于具塞反應管中，加入5 mL 2-硫代巴比妥酸，封口，振蕩并置于沸水中35 min。用5 mL蒸餾水作對照。然后將反應管于冷水中冷卻10 min，測定其在538 nm處的吸光度(OD)。用公式(1)計算TBARS值。

TBARS值(mg丙二醛/kg樣品)=7.8×OD538 nm

(1)

1.3.5 剪切力測定

選用國產C-LM2型肌肉嫩度儀進行測定。取不同排酸時間牛肉，除去肉樣表面脂肪、筋腱和膜。然后打開塑料薄膜包裝袋，將熱電偶插入肉樣中心處，包扎好肉樣，保持袋口向上，放入80 ℃恒溫水浴鍋中，加蓋持續加熱至肉樣中心處溫度達71 ℃。取出肉樣，冷卻至室溫后用直徑1.27 cm的圓形取樣器沿與肌纖維平行的方向鉆取肉樣(避開筋腱)，孔樣長度不少于2.5 cm，取樣位置距離樣品邊緣不少于5 mm，2個取樣的邊緣間距不少于5 mm，剔除有明顯缺陷孔樣，測定樣品數量不少于3個。

1.3.6 肌原纖維小片化指數測定

參照CULLER等[10]的方法，并稍作修改。將肉樣除去可見脂肪和結締組織后剪碎，準確稱取4.0 g肉樣，加入40 mL預冷的(2 ℃)MFI緩沖液(100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH 7.0)進行裂解，高速勻漿3次(4 ℃，每隔l min勻漿20秒)；冷凍離心(4 ℃，1 000 g，15 min)，棄去上層清液，沉淀用40 mL預冷的MFI緩沖液懸浮，再冷凍離心(4 ℃，1 000 g，15 min)，去上層清液，將沉淀用10 mL預冷的MFI緩沖液充分懸浮，后使用150目濾布過濾除去結締組織碎片，再用10 mL預冷的MFI緩沖液沖洗試管，進行過濾，2次濾液混勻后即為肌原纖維提取液。采用雙縮脲法測定肌原纖維提取液的蛋白質濃度。然后采用MFI緩沖液將懸浮液蛋白質質量濃度調整為0.5 mg/mL，在540 nm處測吸光度MFI值的測定見公式(2)。

MFI值=OD540nm×200

(2)

1.3.7 加壓失水率測定

取背最長肌肉樣，肉塊長×寬×高不少于5 cm×5 cm×1 cm(厚度方向為肌纖維方向)，平置于潔凈的塑料板上，用直徑為2.523 cm的圓形取樣器，切取中心部分背最長肌肉樣一塊，立即用感應量為0.01 g的天平稱重，在肉樣上、下方各覆蓋一層醫用紗布，紗布外面各墊48層吸水性好的普通衛生紙或18層化學定性分析濾紙。濾紙外再各墊一片硬質塑料板，將墊好的肉樣置于系水力測定儀的平臺上，緩慢勻速搖動壓力儀的搖把，使壓力儀百分表上顯示出相當于35 kg的讀數，并保持此壓力5 min，撤去壓力后立即稱重，壓失水率見公式(3)。

(3)

式中：Wa，加壓前肉重；Wb，加壓后肉重。

1.3.8 僵直指數測定

參照BITO等[11]測定魚肉僵直指數的方法，將其運用到牛肉中，順著牛肉肌纖維方向取一定長度背最長肌肉樣，置于水平板上，測出牛肉長度的中點，使牛肉的前1/2置于水平板上，后1/2自然下垂，測定其尾端與水平板構成的最初下垂距離(L0)和在不同排酸時期的距離(Lt)，用公式(4)計算僵直指數(R)。重復10次，結果以平均值±標準差表示。

(4)

1.3.9 蛋白質熱性質測定

用差示掃描量熱法(differential scanning calorimeter,DSC)對排酸牛肉蛋白質的熱變性情況進行分析。儀器先用銦校準，然后稱取15～20 mg肉樣于鋁質樣品盤中，密封后放置于樣品艙中，加熱溫度從20 ℃上升至100 ℃，溫度上升速度為10 ℃/min，在初始溫度20 ℃處平衡2 min。以空的鋁質盤作為對照。用軟件Universal Analysis 2000分析蛋白質的熱力學參數：Tp(最大變性溫度)和ΔH(變性焓值)。每個樣品至少進行3次重復。

1.4 數據處理與分析

所有數據用平均值±標準差表示。采用Microsoft Office Excel 2003制表和繪圖，采用SPSS 19.0全因子模型對測定結果進行顯著性分析。差異顯著水平α為0.05。

2 結果與分析

2.1 牛肉的細菌總數

對于在4 ℃環境中排酸的牛肉來說，微生物增長是導致其腐敗變質的主要原因[12]。由圖1可知，排酸時間對牛肉中微生物的增長有顯著影響(P<0.05)，細菌總數隨排酸時間的延長呈逐漸上升趨勢。排酸初期(12～24 h)牛肉中的細菌總數增幅較小，并無明顯差異(P>0.05)，主要由于環境的改變，微生物處于生長遲滯期。排酸24 h后的牛肉細菌總數增幅明顯(P<0.05)，此時的微生物進入對數生長期。同時也可以推測，排酸12～24 h的牛肉可能處于僵直急速形成期，肌肉pH較低，不利于微生物的生長，而排酸24 h后的牛肉僵直逐漸解除，肌肉pH不斷升高，微生物開始迅速繁殖。國家標準規定新鮮肉的細菌總數不超過1×106CFU/g，而排酸至168 h時的牛肉中細落總數為6.2×105CFU/g，未超出肉品新鮮度標準，仍符合食用要求。

2.2 牛肉的TVB-N值

揮發性鹽基氮值是肉類由于肌肉內源酶或外界微生物的感染而繁殖分泌酶所引起的脫胺、脫羧等作用，使蛋白質分解產生氨及胺類等堿性含氮物質，其含量高低可用于判斷肉類的新鮮程度[13]。TVB-N值越大，表示由蛋白質分解產生的堿性含氮物質越多，肉的新鮮度越低[14]。由圖2可知，隨著排酸時間的延長，牛肉的TVB-N值呈逐漸上升趨勢，且差異顯著(P<0.05)。排酸初期，即12 ～24 h范圍內的牛肉TVB-N值無明顯變化(P>0.05)。排酸24 h后牛肉的TVB-N值增幅明顯(P<0.05)，樣品中的微生物處于對數生長期，代謝旺盛、酶系活躍，分解蛋白質的能力逐漸加強，蛋白質分解產生的堿性含氮物質不斷累積，表現出TVB-N值的不斷上升。國家標準規定的肉類新鮮度對應的TVB-N值為：鮮肉≤15 mg/100 g，次鮮肉15～20 mg/100 g，變質肉>20 mg/100 g。排酸168 h時，牛肉的TVB-N值上升至15.52 mg/100 g，但只稍超出次鮮度范圍，依舊保持新鮮可食狀態。

2.3 牛肉的TBARS值

脂肪氧化是引起肉品質發生腐敗變質的主要因素之一，且會降低肉的耐貯藏性[15]。硫代巴比妥酸值是判斷肉類食品脂肪氧化程度的有效指標，TBARS值越高，表明脂肪氧化程度越高，肉的腐敗程度越大[16]。如圖3所示，排酸12～48 h內，牛肉的TBARS值升幅明顯(P<0.05)，排酸72 h與排酸48 h牛肉的TBARS值無顯著差異(P>0.05)，伴隨著排酸時間的繼續延長，牛肉脂肪的氧化速度增加明顯，這也與排酸后期微生物生長迅速有關，此時有部分微生物分泌出的脂肪酶加速了肌肉脂肪的水解，提高了脂肪氧化程度。通常認為新鮮肉品的最大TBARS值在0.7～1.0 mg/kg之間，當肌肉的TBARS值處于0.20～0.66 mg/kg時為新鮮肉，超過1.0 mg/kg則為已被嚴重氧化的變質肉，不再具備可食用性[17]。由圖3可知，當排酸時間達168 h，牛肉的TBARS值雖上升至0.57 mg/kg，但仍處于新鮮肉的范疇。

2.4 牛肉的剪切力和MFI值

嫩度是評價肉品質量高低的重要指標之一[18]，也是消費者評判肉質的最常用指標。牛肉嫩度主要由肌肉中結締組織含量、肌漿蛋白含量、肌纖維直徑與大理石紋理結構所決定[19]。剪切力大小可有效反映肉品的嫩度好壞，是評價牛肉嫩度的客觀指標。由表1可知，排酸時間對牛肉的剪切力有顯著影響(P<0.05)，隨著排酸時間的延長，牛肉的剪切力值總體呈先增加后減小趨勢。牛肉的剪切力在排酸24 h時迅速增加至最大值96.22 N，推測此時的牛肉進入僵直期，由于肌肉中的ATP含量急劇下降，肌肉的伸縮性較差，肉質變硬導致。隨著排酸過程的繼續，排酸168 h牛肉的剪切力值僅占排酸24 h牛肉的56.6%，也遠低于剛屠宰后牛肉的剪切力，可見排酸處理可有效改善牛肉嫩度，且排酸時間越長，嫩度的改善程度越明顯。

注：同列標注字母不同者表示差異顯著(P<0.05)。下同。

肌原纖維小片化指數反映了肌原纖維蛋白降解及其結構被破壞的程度。排酸過程中肌原纖維蛋白和細胞骨架蛋白的降解對于肌肉的嫩化起重要作用，MFI增大，肌肉嫩度提高[20]。由表1可知，牛肉MFI值在排酸12～72 h內顯著增大(P<0.05)，在排酸72～168 h內雖有顯著性增大，但數值逐漸趨于穩定。相比排酸12 h時的49.11，排酸168 h牛肉的MFI值增加到了81.61，結果充分顯示，排酸顯著影響了牛肉的肌原纖維小片化程度，這在排酸早期的變化最為明顯。已有大量研究表明，MFI值越高，肌肉嫩度越好[21-22]，而排酸72～168 h的牛肉MFI值較之前均有顯著增加(P<0.05)，肌肉嫩度得到極大改善。因此，結合剪切力的有利變化，可選擇排酸72～168 h作為牛肉較優的烹煮時機。

2.5 牛肉的保水性能

加壓失水率是衡量肉品保水性能的主要指標之一。由圖4可知，排酸時間對牛肉的加壓失水率有顯著影響(P<0.05)。牛肉的加壓失水率隨著排酸時間的延長總體呈先升高后降低趨勢，排酸24 h牛肉的失水率達最大值26.62%，與排酸12 h的牛肉有顯著差異(P<0.05)。隨著排酸過程的繼續，牛肉的失水率逐漸減小，排酸48 h牛肉的失水率降至22.26%。排酸72 h牛肉的失水率降低明顯，排酸120 h牛肉的失水率則繼續降低至最小值12.81%，與成熟168 h的牛肉有差異性，但不顯著(P>0.05)。綜合看來，牛肉的加壓失水率隨排酸時間的延長總體呈先升高后降低趨勢，在排酸72～168 h加壓失水率較低，表現為保水性能的提升，已知肌肉保水能力越強，牛肉品質越好[23]。因此，可選擇排酸72～168 h作為牛肉較優的烹煮時機。

2.6 牛肉的僵直指數

僵直是動物宰后肌肉向可食用肉質轉變過程中發生的最強烈變化之一，即肌肉在某個排酸階段會發生連續且不可逆的收縮，逐步失去彈性與延展性，當收縮至最大限度時便形成了肌肉的僵直[24]。僵直指數可直觀反映肉牛宰后的僵直狀況。由圖5可知，排酸時間對牛肉的僵直指數有顯著影響(P<0.05)，排酸12 h時牛肉的僵直指數為14.58%，在排酸24 h時迅速上升至最大值30.83%，結果充分表明此階段為牛肉的僵直遲滯期[25]，肌肉中的ATP含量雖減少，但降幅較小，肌動球蛋白仍可解離成肌球蛋白和肌動蛋白，使得肌肉仍保持一定的伸縮性與彈性[25]。而排酸12～24 h則為牛肉的僵直急速形成期，此階段牛肉的僵直指數上升明顯(P<0.05)，肌肉中貯存的ATP逐漸消耗殆盡，大量肌動蛋白和肌球蛋白迅速結合形成肌動球蛋白，且無法再解離，肌肉的伸縮性逐漸喪失[26]。排酸24 h時，牛肉的僵直指數達最大值，此時肌糖原不再繼續分解產生ATP，肌肉伸展性徹底消失，這與WHEELER等[27]研究結果一致。隨著排酸過程的繼續，牛肉的僵直指數于排酸72 h降至1.04%，此后趨于穩定。排酸72～168 h的牛肉僵直指數較之前均有大幅下降，肌肉恢復舒張松弛狀態，對肌肉保水性、嫩度和風味均有明顯的改善作用。因此，可選擇排酸72～168 h作為牛肉較優的烹煮時機。

2.7 牛肉蛋白質熱性質

DSC技術是測定肌肉蛋白質熱性質的一種有效手段。蛋白質在受熱變性過程中，多肽鏈展開，分子內相互作用被破壞，該過程需要吸收能量，而吸收熱量是一個由有序狀態變為無序狀態的過程[28]。當達到蛋白質的變性溫度時，熱分析圖譜上會出現吸熱峰，由峰值溫度、峰面積可確定蛋白質的變性溫度、變性熱焓等參數[29]。由圖6可知，排酸期間牛肉蛋白質的熱變性主要表現為2個吸熱峰，已有研究表明，由低溫區到高溫區依次為：峰I代表肌球蛋白及其亞基引起的熱流峰，峰II代表肌動蛋白引起的熱流峰[30]。

已有研究表明，肉類蛋白質中的肌球蛋白及其亞基典型的熱變性溫度范圍是38～67 ℃，肌動蛋白為70～81 ℃[31]，與本文結果相符。由表2可知，排酸時間對牛肉肌球蛋白的變性溫度有顯著影響(P<0.05)，排酸24 h時牛肉肌球蛋白的變性溫度達最大值60.7 ℃，主要因為此時牛肉中的肌動蛋白和肌球蛋白大量迅速地結合形成肌動球蛋白，且難以解離，導致肌球蛋白的熱穩定性迅速提高[32]。隨著排酸時間的繼續延長，肌球蛋白的熱變性溫度不斷下降，顯示熱穩定性的降低。肌動蛋白的變性溫度隨著成熟時間的延長無明顯變化(P>0.05)，肌球蛋白和肌動蛋白的變性溫度變化的極值分別為2.20 ℃和0.80 ℃，進一步顯示相對于肌球蛋白，肌動蛋白的熱穩定性更高。牛肉的肌球蛋白與肌動蛋白在排酸24 h時吸熱變性所需熱焓值均達最高，隨后有明顯下降(P<0.05)，主要因為隨著排酸過程的繼續，肌肉中的鈣激活酶對部分關鍵肌原纖維蛋白如伴肌球蛋白、伴肌動蛋白及肌間線蛋白等降解作用導致肌球蛋白與肌動蛋白分子間氫鍵被破壞，使熱焓值逐漸降低[32]。隨著排酸時間的延長，肌肉蛋白質的熱穩定性逐漸降低，更易受熱變性，暗示選擇利用排酸后期的牛肉進行烹煮可有效縮短加熱時間和節約能源。因此，可選擇排酸72～168 h作為牛肉較優的烹調時機。

3 結論

中國西門塔爾牛背最長肌在4 ℃條件下排酸至168 h，其細菌總數、TVB-N值和TBARS值仍在新鮮肉的數值范圍內，依舊新鮮可食。隨著排酸時間的延長，牛肉的剪切力值呈逐漸降低趨勢，MFI值對應呈升高趨勢，且均在排酸72 h時發生明顯變化，此后牛肉的嫩度均得到了有效改善。同時，牛肉的加壓失水率、僵直指數和蛋白質熱穩定性均在排酸72、120、168 h有明顯降低，此階段的肌肉恢復到了舒張松弛狀態、保水性更好、蛋白質更易受熱變性。因此，綜合以上品質指標的有利變化，推薦排酸72～168 h作為牛肉較優的烹煮時機是具有現實意義的。