干腌火腿中微生物多樣性及其分析方法的研究進展

陳林，王正莉，吉莉莉，王衛，張佳敏

(成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106)

干腌火腿 (dry-cured ham)是用帶骨、皮、爪尖的整只豬腿經腌制、洗曬、風干和長期發酵、整形等工藝制成的一種生肉制品[1]。干腌火腿作為傳統發酵食品之一，有著悠久的發展歷史。幾百年來，不同地域間人們生產加工火腿的工藝各有不同，逐漸形成了不同地域特點的產品。國外著名的干腌火腿主要有法國的Bayonne火腿和Corsican火腿、西班牙的 Iberian火腿和Serrano火腿、意大利的Parma火腿和Light Italian Country火腿、美國的Country-style火腿和德國的Westphalia火腿，而我國較著名的有浙江金華火腿、江蘇如皋火腿、云南宣威火腿、貴州盤縣火腿等[2-5]。

1 干腌火腿中微生物的作用

干腌火腿中對發酵起到重要作用的菌群主要有葡萄球菌、乳酸菌、酵母、霉菌等。干腌火腿中的米酒乳桿菌具有蛋白酶和脂肪酶的活性，一些細菌素對產品風味及貯藏性的提高具有重要作用。葡萄球菌和微球菌能起到分解過氧化物、降解蛋白質和脂肪的作用。有研究報道發現，宣威火腿中的一些葡萄球菌、微球菌與霉菌共同作用，對火腿獨特風味的形成具有基礎性作用。霉菌對火腿外觀的形成有重要作用，通過霉菌生長一方面可以消耗氧氣，防止肉品氧化、褪色，另一方面可以抑制腐敗菌的生長。霉菌還可以生成蛋白酶、脂肪酶，使產品產生獨特風味物質。火腿上的霉菌與火腿色、香、味的形成有著直接關系，在金華火腿傳統生產工藝中，霉菌的各項特征是感官檢查火腿質量好壞的標志之一。酵母的作用在于能使火腿中的維生素E、脯氨酸等香甜成分增加[6]。

2 干腌火腿中微生物菌群的分析方法

目前用于干腌火腿中微生物的相關研究方法主要包括兩大類，一類是純培養分析法[7,8]，另一類是借助分子生物學手段的免培養分析法[9]。

2.1 純培養分析法

純培養分析法是利用不同的培養基對試樣中的微生物進行培養，然后通過形態學、生理生化等方法進行分離、計數、鑒定，得到微生物多樣性數據的一種傳統有效方法。目前，對干腌火腿微生物多樣性相關的研究報道大多采用此種方法。

胡萸英等[10]早在20世紀80年代就用純培養法從金華火腿中分離出大量微生物。其中霉菌主要有青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、芽枝霉(Cladosporium)、交鏈孢霉(Alternaria)等。酵母菌主要有裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、隱球酵母屬(Cryptococcus)等。細菌主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、微球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacteriu)等。甄宗圓等[11,12]發現用傳統工藝加工金華火腿過程中，上鹽后，火腿內部微生物數量減少，進入發酵房后很快可增加至最高106CFU/g，但在火腿成熟生香期，內部微生物數量又下降至103CFU/g。內部細菌占優勢的是葡萄球菌，其次是乳酸菌(主要有消化乳桿菌、馬脲片球菌和戊糖片球菌等)，變異微球菌的數量也較多。內部酵母菌群中主要有類筒假絲酵母、漢遜德巴利酵母、賽道威漢遜酵母、紅酵母等。余翔[13]發現現代工藝加工過程中金華火腿內部的細菌優勢種為乳酸菌、葡萄球菌；內部主要的酵母菌是歐諾比假絲酵母、紅酵母、賽道威漢遜酵母、白色布勒擲孢酵母、多形漢森酵母等。

江東福等[14]研究宣威火腿時鑒定出表層生態菌圈中有17個屬的真菌群：曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、根霉屬(Rhizupus)、毛霉屬(Mucor)、擬青霉屬(Paecilomyces)、長蠕孢霉屬(Helmithosporium)、交鏈孢霉屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、刀孢霉屬(Clasterosporium)、葡柄霉屬(Stemphylium)、束絲菌屬(Ozonium)、膠霉屬(Gliocladium)及酵母和酵母狀真菌中的酵母屬(Saccharomyces)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、黑酵母(black yeast)和7個屬的放線菌群。曲霉、青霉、酵母和鏈霉菌等屬是宣威火腿的主要菌群。馬萍等研究認為宣威火腿酵母菌群占火腿總菌群的60%～70%，青霉、木霉、根霉、毛霉、黑曲霉等有益或無害菌群占8%～15%，煙曲、黃曲、雜曲霉等無益菌群占7%～10%，細菌占10%左右。李平蘭等[15]研究發現宣威火腿中的優勢菌為葡萄球菌、微球菌和霉菌，而乳酸菌及腸桿菌、腸球菌的數量均明顯低于優勢菌群。

蔣云升等[16]對如皋火腿微生態體系進行的研究表明, 火腿中心部位發酵前期的菌系構成為嗜鹽性球菌、桿菌和酵母, 中期以球菌和酵母為主, 后期只有球菌和少量的酵母分布。

李欣蔚等[17]用傳統培養法研究發現劍門火腿中的微生物主要為葡萄球菌、微球菌和酵母菌，其表層數量明顯高于內部，乳酸菌主要分布于火腿內部，霉菌主要存在于火腿表層。

胡永金等[18]對傳統工藝制作的三川火腿加工中微生物區系的動態變化規律進行了研究，發現腌制期、風干期和焐灰期分別為三川火腿表面以及內部細菌和葡萄球菌數量的增長期、穩定期和減少期; 除腌制初期外，火腿內部假單胞菌數量均高于其表面，且在整個加工過程中由于微生物之間的競爭性關系呈逐漸降低趨勢，腌制后期為火腿表面和內部霉菌數量的急劇增長期，但在焐灰期驟減。

黨喜軍[19]用傳統純培養法研究發現諾鄧火腿表面微生物非常豐富，3年期火腿的細菌和真菌類群豐度最高。霉菌中的優勢菌群為曲霉屬(Aspergillus)，酵母菌類群的優勢菌群為德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和假絲酵母屬(Candida)，細菌類群中的優勢菌群為葡萄球菌屬(Staphylococcus)。此外，芽孢桿菌屬細菌也被分離檢測到，該屬菌群大多能產生具有較強蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性的消化酶，有利于火腿中大分子物質的分解。

純培養分析法最大的優點是可以獲得培養菌株，對后續功能菌株的篩選與應用提供豐富的資源。許多研究者基于培養依賴法對分離出的微生物進行了大量的研究。Lori等[20]從Parma火腿內部樣品中分離出了耐鹽菌。潘明等從篩選到能夠產鮮、產香的5株葡萄球菌、2株桿菌、1株酵母菌，發現篩選的菌株都有較好的耐鹽性、耐亞硝酸鹽性，其中一些菌株具有蛋白酶和脂肪酶活性。并將其中部分菌株組合為發酵劑，進行了火腿發酵工藝的優化，得到了較好的發酵效果。顧于濱[21]按照肉制品發酵劑篩選標準從金華火腿發酵菌中篩選出了植物乳桿菌、彎曲乳桿菌和木糖葡萄球菌。將其運用于發酵香腸的生產，發現植物乳桿菌和木糖葡萄球菌能通過抑制脂肪的氧化顯著改善發酵香腸的品質，并且能通過減少生物胺的形成來提高香腸的安全性。

2.2 免培養分析法

采用傳統常規分離純化和培養的方法來研究火腿中的微生物存在著不可避免的缺陷[22]，據報道，在自然界中有90%～99%的微生物用傳統方法無法培養出來，這就人為改變了原始菌群的微生態構成，對研究結果造成較大偏差[23]。因此，以免培養分析法為基礎的分子生物學方法開始在火腿微生物多樣性研究中被運用。目前在干腌火腿中已被開發應用的主要是高通量測序技術(high throughput sequencing，HTS)。該技術不需要大規模的投入，對加速生物學及生物醫學的研究具有引人矚目的作用[24]。它通過測定樣本中存在的細菌16S rRNA、真菌16S rRNA或內轉錄間隔區(ITS)特定區域堿基序列，可一次性對幾十萬到幾百萬條的DNA分子進行序列測定[25]。高通量測序技術可以檢測到大量不同分類水平的微生物，包括純培養物和許多未知的新分類單元。Ge Qingfeng等[26]用高通量技術比較了具有5年、15年和30年金華火腿廠不同廠齡廠家生產的火腿產品微生物多樣性情況，共獲得了18個門、242個屬的微生物，不同廠齡產品中微生物多樣性結構特點和風味物質情況有顯著性差異，結果提示不同廠齡金華火腿廠可以形成特有的平衡的微生物多樣性結構，可能對火腿獨特風味的形成有貢獻。黨喜軍用高通量測序技術對諾鄧火腿的真菌研究表明，優勢真菌類群主要分布在子囊菌門和擔子菌門，種類最多的4個屬分別為尾孢屬、假絲酵母屬、節擔菌屬、曲霉屬。細菌高通量測序結果發現，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍菌門和放線菌門是門水平優勢細菌類群，而屬水平優勢細菌類群主要是葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬和志賀氏菌屬。

母雨等用Illumina高通量測序技術從盤縣火腿中共鑒定出24個細菌門，433個細菌屬，其中厚壁菌門、變形菌門和放線菌門是最多的；共分離鑒定出2個真菌門，68個屬，優勢菌是子囊菌門。

張詩意等[27]通過PCR法鑒定出了貴州威寧火腿中的10株菌株，其中有4株馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、2株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、2株乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、1株變平滑假絲酵母菌(Candidametapsilosis)和1株近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis)；并發現了部分菌株有較強的耐鹽和耐低溫能力。

鄒穎玲等[28]利用PCR-DGGE技術從不同加工年份宣威火腿中檢測到27種真菌，主要有：Aspergilluspseudoglaucus，Phialosimplexcaninus，Aspergilluspenicillioides，Yamadazymatriangularis，Wallemiasebi，Candidaglucosophila等，其中Aspergilluspseudoglaucus是優勢菌種。多樣性分析表明，加工3年的宣威火腿表面真菌群落多樣性最高，加工2年的火腿表面真菌群落多樣性最低。加工2年的火腿內部真菌群落多樣性最高，加工3年的火腿內部真菌群落多樣性最低。

免培養分析法中，除了高通量測序技術外，變性梯度凝膠電泳(DGGE)、實時熒光定量PCR等也被廣泛應用到了微生物多樣性的研究中[29]。另外，DNA宏條形碼、寡核苷酸配型技術、Biolog微平板法，脂肪酸甲酯譜圖法、熒光原位雜交(FISH)、RFLP等相關技術也是微生物多樣性分析的常用技術[30]。

3 總結與展望

目前，火腿微生物多樣性相關研究結果主要還是用傳統培養法獲得，PCR-DGGE和高通量測序等相關技術還很少有報道。DNA宏條形碼、寡核苷酸配型技術、Biolog微平板法、脂肪酸甲酯譜圖法、熒光原位雜交(FISH)、RFLP等分析方法在獲取微生物多樣性信息方面各有優劣，因此為了獲取更加全面、準確的微生物群落組成、結構及變化等信息，需要結合實際研究目標，采取多層次、多角度的研究手段，通過多種分析方法的互補，實現準確、完整解析微生物群落及其代謝產物的動態變化過程，從而實現火腿發酵過程中產品品質、安全及穩定的可控性。