液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中壬基酚殘留

王浩，賈婧怡，于曉瑾，張杉，張旭，陳江龍

國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心（北京 100094）

壬基酚（NP）是一種重要的精細化工原料和中間體，主要用于生產(chǎn)表面活性劑及抗氧化劑、紡織印染助劑、潤滑油添加劑、農(nóng)藥乳化劑、樹脂改性劑、樹脂及橡膠穩(wěn)定劑等。目前，全世界壬基酚產(chǎn)量接近40萬 t。壬基酚是一種半揮發(fā)性有機化合物，易于在不同環(huán)境中遷移，廣泛存在于環(huán)境中。飼喂動物的飼料、土壤和灌溉水源都有可能受到壬基酚污染，從而導(dǎo)致食品中壬基酚殘留。若長期食用含有壬基酚的食品，可直接干擾內(nèi)分泌功能，導(dǎo)致性早熟、免疫力下降等，對嬰幼兒的正常發(fā)育影響尤為顯著。在缺少國家限量標準的情況下，相關(guān)監(jiān)管部門已將其作為風(fēng)險因子進行監(jiān)測，且規(guī)定了嬰幼兒配方乳粉中壬基酚殘留臨時限量值，為≤600 μg/kg。國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心依據(jù)此次試驗方法對國內(nèi)116份常見食品（包裝飲用水、植物油、液體乳、飲料、面包、餅干、畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品、果蔬、嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒配方米粉及嬰幼兒果泥等）進行檢測，共檢出109份陽性樣品，含量為2.1～479 μg/kg，檢出率為94.0%，說明壬基酚殘留問題在我國食品中普遍存在。因此，為給監(jiān)督執(zhí)法機構(gòu)提供強有力的技術(shù)支撐和依據(jù)，以便在最大程度上保護消費者健康、維護我國產(chǎn)品在國際市場上的地位和信譽，開發(fā)簡便、快速、準確、靈敏度高且適用于常見食品類的壬基酚殘留國家標準檢測方法具有重大的現(xiàn)實意義。

目前，測定壬基酚殘留的文獻比較多，方法主要是氣相色譜-質(zhì)譜法[1-3]、高效液相色譜法[4-6]和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]等。此次試驗針對不同食品基質(zhì)特點，對樣品提取、凈化，色譜、質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，建立了靈敏度高、操作簡單且適用于各類食品中壬基酚殘留的準確定性、定量分析方法。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈（色譜純，德國Fisher公司）；壬基酚、3, 5, 3-壬基酚-13C6（≥99%，Dr. Ehrenstorfer公司）；試驗所選用樣品為國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心檢驗樣品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配Agilent 1200型液相色譜儀（美國Agilent公司）；GL-16G-II型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-5200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Milli-Q公司）。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取10.0 mg（精確至0.1 mg）4-壬基酚標準品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為200 mg/L的標準儲備液，于-18 ℃保存，存效期為6個月。

同位素內(nèi)標標準儲備液：準確稱取10.0 mg（精確至0.1 mg）3, 5, 3-壬基酚-13C6標準品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為200 mg/L的標準儲備液，于-18 ℃保存，存效期為6個月。

標準中間液：準確吸取0.5 mL標準儲備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標準中間液，于-18 ℃保存，存效期為3個月。

同位素內(nèi)標中間液：準確吸取0.5 mL同位素內(nèi)標標準儲備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的同位素內(nèi)標中間液，于-18 ℃保存，存效期為3個月。

標準系列工作液：分別準確吸取10，20，50，100，200和1 000 μL標準中間液，以及200 μL同位素內(nèi)標中間液，用乙腈稀釋并定容至10 mL。壬基酚質(zhì)量濃度依次為1.00，2.00，5.00，10.0，20.0和100 ng/mL，標準工作液中3, 5, 3-壬基酚-13C6質(zhì)量濃度為20 ng/mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

包裝飲用水壬基酚標準系列工作液質(zhì)量濃度配制為0.025，0.050，0.10，0.20，0.50和1.0 ng/mL，標準工作液中3, 5, 3-壬基酚-13C6質(zhì)量濃度為20 ng/mL。現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 色譜和質(zhì)譜分析條件

1.3.1 色譜分析條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18柱，1.9 μ m，4.6 mm×50 mm，配備預(yù)柱。流速0.35 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量3 μL（包裝飲用水樣品，進樣量50 μL）。流動相，甲醇-水（10∶90，V/V）。

1.3.2 質(zhì)譜分析條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，負離子模式；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣，N2；霧化氣壓力，413.8 kPa；干燥氣溫度，340 ℃；干燥氣流速，8 L/min。

1.4 樣品處理

包裝飲用水：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，加入20.0 μL同位素內(nèi)標中間液，渦旋振蕩10 s，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

液體乳、果汁等液態(tài)飲品：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標中間液，渦旋振蕩10 s后，再加入乙腈3.0 mL（酸奶、果汁等酸性樣品加入2%氨水乙腈），加塞后劇烈振搖1 min左右，超聲提取10 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

油脂類食品：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣（固態(tài)試樣需60 ℃水浴液化），置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標中間液，渦旋振蕩10 s后，再加入3.0 mL乙腈，加塞后用手劇烈振搖1 min左右，靜置30 min，待分層后，吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

面包、餅干、大米、面條等谷物及其制品：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于10 mL玻璃離心管中，加入20.0 μ L同位素內(nèi)標中間液，再加入4.0 mL 70%乙腈水溶液（面包樣品加入6.0 mL），渦旋振蕩30 s后，超聲提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

豬肉、魚肉等動物源性食品：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標中間液，再加入4.0 mL乙腈，渦旋振蕩10 s后，超聲提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

胡蘿卜、蘋果等果蔬類食品：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標中間液，再加入3.0 mL乙腈（蘋果等酸性水果樣品加入2%氨水乙腈），渦旋振蕩10 s后，超聲提取30 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

乳粉（含嬰幼兒配方乳粉）：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于10 mL玻璃離心管中，依次加入20.0 μL同位素內(nèi)標中間液和2.0 mL 50 ℃左右熱水，渦旋振蕩10 s后，再加入4.0 mL乙腈，加塞后劇烈振搖至蛋白質(zhì)沉淀，超聲提取10 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

米粉（含嬰幼兒配方米粉）：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于10 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標中間液，再加入6.0 mL 50%乙腈水溶液，渦旋振蕩30 s后，超聲提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

嬰幼兒營養(yǎng)果泥：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標中間液，再加入3.0 mL 2%氨水乙腈，渦旋振蕩10 s后，超聲提取30 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件選擇

壬基酚是一種重要的精細化工原料和中間體，不溶于水，略溶于石油醚，溶于丙酮、四氯化碳、乙腈、乙醇和氯仿。在該方法所適用的食品基質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)組分對壬基酚提取、檢測產(chǎn)生最大干擾，比較上述這幾種有機試劑的除蛋白效果，發(fā)現(xiàn)乙腈既能有效提取壬基酚，又能去除樣品中蛋白質(zhì)，其余幾種去除蛋白效果不好，所以采用乙腈超聲提取目標化合物。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，對壬基酚進行減壓旋蒸濃縮和氮吹濃縮時，目標化合物低濃度時重現(xiàn)性比較差，所以不宜采取濃縮富集處理。由于食品基質(zhì)成分比較復(fù)雜，且普遍存在油脂成分，所以樣品前處理通常采用化學(xué)除油、過膜等凈化步驟。經(jīng)大量試驗發(fā)現(xiàn)，很多溶劑（正己烷、乙酸乙酯等）、固相萃取柱、各種QuEChERS填料、各種濾膜均有壬基酚殘留，所以該方法不采用除油和過膜處理，最終采用4 ℃條件下以15 000 r/min后直接進樣。同時通過大量試驗優(yōu)化，最終確定3 μL進樣量，且該方法規(guī)定色譜柱需要配保護預(yù)柱，這樣極大減小了測定液中雜質(zhì)對色譜柱的不良影響。標準起草單位用這種前處理方法每年完成3 000批次左右的壬基酚檢測任務(wù)，均未發(fā)現(xiàn)對色譜柱和質(zhì)譜有不良影響。

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

該方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μ m）、Hypersil GOLD C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）和Agilent Extend-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）進行分離試驗，發(fā)現(xiàn)Hypersil GOLD C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）峰形及出峰時間較為合適。

2.2.2 流動相的選擇

壬基酚為中等極性化合物，為了利于色譜峰的分離及峰型的改善，該方法的流動相首先采用梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以空白試劑為樣品會出現(xiàn)假陽性的情況。經(jīng)過反復(fù)試驗，確定采用等度洗脫，流動相為甲醇-水（10∶90，V/V）；流速為0.35 mL/min，出峰時間在4 min左右，5 min能完成1次樣品測定。結(jié)果見圖1。

圖1 壬基酚及其同位素內(nèi)標的MRM 色譜圖

2.2.3 進樣量選擇

為了減少測定液中雜質(zhì)對色譜柱影響，且確保目標物的出峰時間、峰型、響應(yīng)強度達到最優(yōu)狀態(tài)，采用進樣3 μL、配保護預(yù)柱。針對包裝飲用水樣品，為了提高樣品中壬基酚的檢出限，選擇進樣50 μL。

2.3 同位素內(nèi)標選擇

試驗分別選取了氘代4-正-壬基酚和碳13標記3,5, 3-壬基酚作為內(nèi)標進行對比研究。具有直鏈結(jié)構(gòu)的氘代4-正-壬基酚，其碎片離子質(zhì)荷比為112，標準品4-壬基酚的碎片離子質(zhì)荷比分別為132.9和147。因此，二者母離子碎裂方式可能不同，且液相保留時間也不相同。這可能會造成目標化合物在離子源中的離子化效率不同而影響定量結(jié)果。具有支鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)標（碳13標記3, 5, 3-壬基酚）的碎片離子與標準品4-壬基酚相同。所以碳13標記的3, 5, 3-壬基酚可以更好地校正測定過程對目標化合物的影響，更適合作4-壬基酚混合物標準品的內(nèi)標。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用直接進樣方式分別將質(zhì)量濃度為100 ng/mL的壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6注入離子源中，在負離子掃描模式下進行母離子全掃描，得到壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的分子離子峰，分別為219.2和225.2。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令規(guī)定對于質(zhì)譜確證方法必須達到4個確證點的要求，低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個以上的子離子。以該離子峰為母離子，進行二級質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化，定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強度比例達到最大時為最佳，得到壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的最佳質(zhì)譜參數(shù)。壬基酚在碰撞能量分別為30和20 eV時，m/z132.9和m/z147.0碎片離子的強度比較大，因此選擇這兩個離子作為定量及定性的檢測離子。3, 5,3-壬基酚-13C6在碰撞能量為35 eV時，m/z139.1碎片離子的強度比較大，因此選擇這個離子作為定量檢測離子，結(jié)果見表1。

2.5 線性關(guān)系、檢出限及定量限

用標準系列工作液，分別進樣3 μL（包裝飲用水樣品，進樣量50 μL），測定結(jié)果經(jīng)線性回歸（y為峰面積，Counts；x為質(zhì)量濃度，μg/L），同時用選擇空白樣品，定量添加標準溶液，按照方法中介紹的步驟操作，當(dāng)所得譜圖的信噪比大于3時，將此添加量定為最低檢出限；當(dāng)信噪比大于10時，將此添加量定為最低定量限，結(jié)果見表2。

表1 壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的質(zhì)譜參數(shù)

表2 壬基酚的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)檢出限及定量限

2.6 方法的回收率和精密度

分別選取具有代表性的樣品進行回收率與精密度試驗。準確稱取包裝飲用水、椰汁、植物油、餅干、魚肉、蘋果、嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒配方米粉、嬰幼兒營養(yǎng)果泥等典型樣品各6份，每份1.0 g，共3組，分別定量加入4-壬基酚標準物質(zhì)和內(nèi)標物，因為考慮到很難找到陰性樣品，為了更好考察方法的回收率與精密度，加標水平分別設(shè)定為10，20和100 μ g/kg，按樣品前處理進行測定。試驗結(jié)果表明，不同濃度平均加標回收率為86.0%～114.3%，平均相對標準偏差為2.8%～9.5%（n=6）。

表4 典型樣品基質(zhì)中壬基酚的加標回收率和精密度

接表4

2.7 實際樣品檢測

使用該方法對市售的116份食品進行了檢測，共檢出109份陽性樣品，含量為2.1～479 μg/kg，檢出率為94.0%，其中嬰幼兒配方乳粉殘留量較高，但含量未超出我國臨時限量值（≤600 μ g/kg）。上述結(jié)果表明，我國食品中確實存在壬基酚殘留，其對消費者健康存在的風(fēng)險應(yīng)當(dāng)引起重視。

3 結(jié)論

根據(jù)實際樣品檢測數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)嬰幼兒營養(yǎng)乳粉中壬基酚的檢出率較高，考慮到嬰兒配方乳粉是0～6個月齡的嬰兒的唯一食物來源，長期食用含有壬基酚的乳粉對嬰兒的危害是極為顯著的，必須引起高度重視。此次試驗所建立的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，實現(xiàn)了食品壬基酚殘留準確測定，該方法為相關(guān)執(zhí)法監(jiān)督和食品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，為我國的食品質(zhì)量安全工作給予技術(shù)支持。