替米沙坦和氯沙坦對胰島素抵抗大鼠冠狀動脈脂聯(lián)素受體和胰島素抵抗的影響

心血管疾病是全世界死亡的主要原因。肥胖、血脂異常和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)與心血管疾病緊密相關(guān)。IR可引起心血管疾病的發(fā)展，產(chǎn)生慢性高血糖，進而引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及細胞損傷，促進動脈粥樣硬化斑塊形成[1]。脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是由Scherer等在1995年發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細胞分泌的特異性蛋白，APN通過細胞膜上APN受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，目前研究較多的受體主要包括脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)和T-鈣黏素。已有研究提示，IR、肥胖、血脂代謝異常、冠心病及高血壓病人血清APN水平降低，血清APN與冠狀動脈預(yù)后密切相關(guān)[2]；血液循環(huán)APN水平提高可降低2型糖尿病危險性；血清APN水平與血糖和胰島素水平呈負相關(guān)[3]。

血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor blockers，ARBs)替米沙坦，具有降壓和改善IR作用，抑制糖尿病病人重構(gòu)，其機制由于部分激活過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ(PPAR-γ)功能，替米沙坦可提高糖尿病病人血清APN水平，高血糖所致APN受體表達下降與內(nèi)源性血管緊張素Ⅱ水平增高有關(guān)，其他血管緊張素受體拮抗劑可增加APN受體的表達。現(xiàn)有循證證據(jù)表明，足量替米沙坦在改善高血壓病人胰島素敏感性和IR方面優(yōu)于其他血管緊張素受體拮抗劑，并增加糖尿病病人APN水平，降低空腹血糖，改善空腹胰島素水平[4]。本研究探討替米沙坦和氯沙坦對IR大鼠冠狀動脈脂聯(lián)素受體和IR的影響。

1 材料與方法

1.1 大鼠IR模型制備和分組 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，隨機選擇6只作為對照組(control group，Con組)，剩余34只予高果糖飼料喂養(yǎng)4周，空腹腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，1周后，測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹血清胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)SI)，計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，ISI=-In(FBG×FSI)，ISI≤-4.88提示造模成功[5]。實驗第5周，將18只IR大鼠分為3組，每組6只大鼠。IR組：生理鹽水灌胃4周；替米沙坦組(TEL組)：替米沙坦5 mg/(kg·d)灌胃4周；氯沙坦組(LOS組)：氯沙坦10 mg/(kg·d)灌胃4周。

1.2 體重、血壓測量 實驗第9周測量4組大鼠體重；應(yīng)用尾動脈血壓儀測量各組大鼠收縮壓、舒張壓和平均動脈壓。

1.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測 實驗結(jié)束后，使用酶法測定各組大鼠血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)和FBG。使用雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法測量血清FSI、APN水平，并計算ISI。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 實驗第9周末，分離冠狀動脈。冠狀動脈組織液氮研磨，提取RNA，立即進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件95 ℃加熱5 min，94 ℃ 20 s，61 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)，72 ℃ 加熱5 min，55 ℃ 10 s。測定3組冠狀動脈AdipoR1、AdipoR2和APN的mRNA表達。所有引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下，APN引物序列(上游引物：5′-acactccggcacctaacatc-3′，下游引物：5′-gtggccaccactttcttgtt-3′)，擴增片段長度為196 bp；AdipoR1引物序列(上游引物：5′-ctgctggtccttcacagaca-3′，下游引物：5′-catccgccaggttacaaagt-3′)，擴增片段長度為172 bp；AdipoR2引物序列(上游引物：5′-acccacaaccttgcttcatc-3′，下游引物：5′-gctagccatgagcattagcc-3′)，擴增片段長度為233 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列(上游引物：5′-CCTGCCAAGTATGATGACATCAAG-3′，下游引物：5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′)，擴增片段長度為75 bp。

1.5 免疫印跡試驗(Western Blot) 蛋白質(zhì)提取，測定各檢測指標(biāo)濃度。SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，加入用抗體稀釋液稀釋的APN(1∶1000稀釋)/AdipoR1(1∶200稀釋)/AdipoR2(1∶200稀釋)/GAPDH抗體(1∶800稀釋)，進行酶標(biāo)二抗孵育，每條膜加入適量的發(fā)光底物試劑，行化學(xué)發(fā)光，得到膠片。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠生物學(xué)指標(biāo)比較(見表1)

組別只數(shù)體重(g)FBG(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FSI(pmol/L)ISIAPN(μg/mL)Con組6474±41 5.46±0.58 0.522±0.036 1.329±0.081 127.8±16.0 -4.42±0.18 12.80±1.26 IR組 6516±61①9.68±2.65①2.335±0.269①4.008±0.551①178.3±19.5①-5.56±0.26①9.11±0.87①TEL組6486±48①8.51±1.60②1.903±0.212②3.827±0.237①168.2±33.0①-5.25±0.23②12.16±1.21②LOS組6506±42①8.96±1.50①2.283±0.189①3.931±0.289①169.9±28.0①-5.35±0.21①13.16±1.42②

與Con組比較，①P<0.05；與IR組比較，②P<0.05。

2.2 4組大鼠血壓比較(見表2)

表2 4組大鼠血壓比較 (±s) 單位：mmHg

注：1 mmHg=0.133 kPa。與Con組比較，①P<0.05；與IR組比較，②P<0.05。

2.3 RT-PCR 至實驗第9周末，IR組冠狀動脈APN mRNA、AdipoR1 mRNA、AdipoR2 mRNA表達明顯低于Con組(P<0.05)，TEL組和LOS組冠狀動脈APN mRNA、AdipoR1 mRNA、AdipoR2 mRNA表達較IR組增高(P<0.05)。詳見圖1。

與Con組比較，＊P<0.05；與IR組比較，#P<0.05。

2.4 4組大鼠冠狀動脈APN、AdipoR1、AdipoR2蛋白表達水平比較 至實驗第9周末，與Con組相比，IR組冠狀動脈APN、AdipoR1和AdipoR2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。與IR組比較，TEL組和LOS組大鼠冠狀動脈APN、AdipoR1和 AdipoR2蛋白表達明顯增高(P<0.05)。詳見表3。

組別只數(shù)APN/GAPDHAdipoR1/GAPDHAdipoR2/GAPDHCon組60.231±0.063 0.199±0.043 0.159±0.023 IR組 60.021±0.014①0.080±0.031①0.082±0.016①TEL組60.153±0.098②0.159±0.031②0.126±0.033②LOS組60.115±0.073②0.119±0.021②0.124±0.018②

與Con組比較，①P<0.05；與IR組比較，②P<0.05。

3 討 論

APN和APN受體是IR中的重要生物學(xué)物質(zhì)和結(jié)合蛋白。AdipoR1、AdipoR2和T-鈣黏素是重要的APN結(jié)合受體，在多個臟器和組織細胞中發(fā)揮改善IR作用。AdipoR1主要在腦、心、腎、肝、肺、骨骼肌、脾及睪丸中表達并發(fā)揮作用，其中骨骼肌含量最豐富；AdipoR2 在肝臟中表達最高；T-鈣黏素在內(nèi)皮細胞和平滑肌中表達最高。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用Western Blot方法在各組大鼠冠狀動脈均可檢測到APN受體AdipoR1和AdipoR2蛋白表達，且于IR時大鼠冠狀動脈AdipoR1、AdipoR1蛋白表達發(fā)生變化；冠狀動脈平滑肌細胞培養(yǎng)后應(yīng)用Western Blot方法可檢測到AdipoR1和AdipoR2蛋白表達，IR或其他因素可調(diào)節(jié)其表達。有研究表明，AdipoR1表達在多種器官病理情況下下調(diào)[6]。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)，APN及其受體通過下調(diào)磷酸化，改變糖尿病和心力衰竭的病理生理機制[7]。有研究已證實，高糖、高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠表現(xiàn)的心臟功能下降與心肌細胞內(nèi)AdipoR1表達下降及AMP依賴蛋白激酶(AMPK)磷酸化減少有關(guān)[8]。本研究中，IR組血清APN、冠狀動脈APN及AdipoR1、AdipoR2表達低于Con組，提示冠狀動脈APN及其受體在胰島素局部IR中具有重要作用。

替米沙坦和氯沙坦均是長效血管緊張素受體拮抗劑，能選擇性地抑制血管緊張素Ⅱ的1型受體(AT1)。替米沙坦與其他血管緊張素受體拮抗劑不同的是，替米沙坦與過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)γ的激動劑吡格列酮化學(xué)結(jié)構(gòu)上有一定的同源性[9-10]。PPARγ激動作用可改善葡萄糖和脂肪代謝，降低血糖、血脂，增加胰島素敏感性，降低心血管疾病風(fēng)險。有研究表明，替米沙坦可上調(diào)心肌APN受體2表達，并上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)。同時替米沙坦可上調(diào)心肌AdipoR1，下調(diào)NADPH 氧化酶亞基p22phox、NADPH氧化酶4(Nox4)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)和重組人結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達，改善糖尿病大鼠心臟功能，通過PPARγ激動調(diào)節(jié)IR，PPAR-γ激動劑表現(xiàn)為劑量-時間依賴方式增強APN的表達和分泌[4，11]。本研究結(jié)果顯示，替米沙坦能改善FBG，輕度緩解IR，不具有PPARγ激活功能的氯沙坦作用相對較弱。可見，替米沙坦和氯沙坦在基因和蛋白水平以調(diào)控IR大鼠冠狀動脈APN和APN受體表達，提示APN受體調(diào)控是多方面的，不僅與PPARγ激動相關(guān)，還可能與血管緊張素Ⅱ相關(guān)。Ushijima等[11]證實替米沙坦和氯沙坦均可增加KK-A(y)糖尿病小鼠APN，并改善IR，兩者無顯著差異。其他研究已發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ灌注導(dǎo)致大鼠心肌肥大，下調(diào)AdipoR1表達，減弱AMPK磷酸化作用，提示血管緊張素Ⅱ通過AdipoR1表達下調(diào)，減弱APN信號作用，最終降低APN的心血管保護效應(yīng)[12-13]。氯沙坦作為AT1拮抗劑，抑制血管緊張素Ⅱ的不良作用，減輕交感興奮，抑制炎癥反應(yīng)，促進血清APN釋放，具有保護冠狀動脈作用[14-15]。

大鼠冠狀動脈內(nèi)存在APN、AdipoR1和AdipoR2表達，IR時上述受體表達受到抑制。替米沙坦和氯沙坦均能增加IR大鼠血清APN水平，減輕IR引起冠狀動脈APN受體表達下降。