熒光定量PCR在腦脊液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測中的應(yīng)用價值分析

劉冬宇 郝艷霞

【摘要】

目的：對熒光定量PCR在腦脊液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測中的應(yīng)用價值展開分析與探討。方法：選擇在我院接受檢查的結(jié)核性腦膜炎患者91例和非結(jié)核性腦膜炎患者42例納入本次研究，分別利用熒光定量PCR和改良羅氏培養(yǎng)法對研究對象的腦脊液樣本進(jìn)行檢測，比較兩種檢測方法的檢測結(jié)果。結(jié)果：熒光定量PCR和改良羅氏培養(yǎng)法對結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)陽性率分別為60.44%、16.48%，相較于改良羅氏培養(yǎng)法，熒光定量PCR對結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的陽性率更高（P<0.05）。結(jié)論：熒光定量PCR在腦脊液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測中的應(yīng)用價值較高，可考慮將其廣泛應(yīng)用至臨床對結(jié)核性腦膜炎的診斷當(dāng)中。

【關(guān)鍵詞】熒光定量PCR;腦脊液;結(jié)核分枝桿菌DNA;應(yīng)用價值

【中圖分類號】R4

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】2095-6851（2020）04-143-01

結(jié)核性腦膜炎很容易被錯誤的診斷為化膿性腦膜炎、病毒性腦炎和腦腫瘤等疾病，且該疾病的病情發(fā)展速度較快、預(yù)后一般不佳，因此，尋找出一種可快速在早期明確診斷結(jié)核性腦膜炎的方法十分必要[1]。本研究旨在對熒光定量PCR在腦脊液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測中的應(yīng)用價值展開分析與探討，研究詳情如下。

1研究對象及方法

1.1研究對象

選擇在我院接受檢查的結(jié)核性腦膜炎患者91例和非結(jié)核性腦膜炎患者42例納入本次研究，研究對象選取時間范圍為2017年2月至2019年4月，91例結(jié)核性腦膜炎患者中62例為男性、29例為女性，年齡最大的75歲，年齡最小的3個月，年齡均數(shù)（39.07±16.35）歲;42例非結(jié)核性腦膜炎患者中27例男性、15例女性，年齡最大的74歲，年齡最小的5個月，年齡均數(shù)（38.54±15.83）歲，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示兩組研究對象基本情況未見有明顯差別，臨床表現(xiàn)可見為均衡性（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑

本研究分別對產(chǎn)自湖南圣湘生物科技有限公司的熒光定量PCR檢測試劑、德國QIAGEN公司的Rotor-Gene Q熒光定量PCR儀和依據(jù)國際防癆和肺病聯(lián)合會推薦配方自行配置的改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行了應(yīng)用。

1.2.2熒光定量PCR

利用震蕩方法將500uL腦脊液和200uL濃縮液混勻，并進(jìn)行每分鐘8000r持續(xù)3分鐘的離心，吸除上清液后加入無菌生理鹽水1ml重懸沉淀，再進(jìn)行每分鐘8000r持續(xù)3分鐘的離心，吸除上清液后留沉渣備用。于沉渣中加入核酸釋放劑50ul，反復(fù)吸打混勻后靜置2-3分鐘。把38uLPCR反應(yīng)液、1uL內(nèi)標(biāo)、2uL酶結(jié)合物和5uL制備好的樣本加入PCR反應(yīng)管中，經(jīng)45個15秒94℃、30秒57℃循環(huán)后進(jìn)行10秒25℃延伸，以使之得到充分反應(yīng)。若Ct值超過39的樣本同時顯示為內(nèi)標(biāo)陽性則認(rèn)定為陰性;若Ct值不足39且曲線呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S形則認(rèn)定為陽性。

1.2.3改良羅氏培養(yǎng)法

在2ml腦脊液中加入2倍量35g/L氫氧化鈉處理液，充分震蕩并放置于37℃的水浴箱中15分鐘，期間進(jìn)行2次震蕩后對標(biāo)本進(jìn)行每分鐘3000r持續(xù)10分鐘的離心，將上清液吸去保留沉淀物。于羅氏培養(yǎng)基中接種0.1ml沉淀物并將其置入36℃孵育箱，分別于第3、7、14、21、28、35、42、49、56天進(jìn)行觀察，若經(jīng)涂片抗酸染色確認(rèn)有菌落生長則為陽性，無菌落生長視為陰性。

1.3評估依據(jù)

比較熒光定量PCR和改良羅氏培養(yǎng)法對結(jié)核性腦膜炎患者及非結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液的檢測結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

使用X2檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料，若結(jié)果為P<0.05，則代表數(shù)據(jù)間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義明顯，所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)皆經(jīng)由SPSS19.0軟件完成。

2結(jié)果

下表1顯示，熒光定量PCR和改良羅氏培養(yǎng)法對結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)陽性率分別為60.44%、16.48%，相較于改良羅氏培養(yǎng)法，熒光定量PCR對結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中結(jié)合分枝桿菌的陽性率更高（P<0.05）。熒光定量PCR和改良羅氏培養(yǎng)法對非結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)結(jié)果皆呈陰性（P>0.05）。

3討論

在所有結(jié)核病當(dāng)中，結(jié)核性腦膜炎是嚴(yán)重程度最高的一種肺外結(jié)核病型，有統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，三成左右的結(jié)核性腦膜炎患者會在接受抗結(jié)核治療后死亡，特別是兒童，對結(jié)核性腦膜炎進(jìn)行早期確診和及時治療是對患者疾病預(yù)后進(jìn)行改善的一項(xiàng)重要手段[2]。

MTB培養(yǎng)法是臨床對結(jié)核病進(jìn)行診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，具有特異性高、精準(zhǔn)、可靠的特點(diǎn)，但一般需對檢驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行4-8周的培養(yǎng)才能獲得結(jié)果，且僅活菌才能被培養(yǎng)出來，使結(jié)核病患者難以在疾病早期得到準(zhǔn)確診斷，耽誤其及時接受對癥治療[3]。為尋找出一種更為理想的結(jié)核菌檢測方法，本研究分別對91例結(jié)核性腦膜炎患者與42肺結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液進(jìn)行了熒光定量PCR和改良羅氏培養(yǎng)法，所得結(jié)果顯示：熒光定量PCR對結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)陽性率為60.44%，明顯高于改良羅氏培養(yǎng)法的16.48%，在很大程度上證明了熒光定量PCR在檢測腦脊液結(jié)核分枝桿菌中的臨床價值。

可見，熒光定量PCR在腦脊液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測中的應(yīng)用價值較高，可考慮將其廣泛應(yīng)用至臨床對結(jié)核性腦膜炎的診斷當(dāng)中。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳利，葛章文，廖萍.熒光定量PCR檢測技術(shù)在結(jié)核診斷中的應(yīng)用探討[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2019，6（8）：155-156.

[2]譚珂，孫炳奇.熒光定量PCR檢測技術(shù)在結(jié)核診斷中的應(yīng)用探討[J].中國醫(yī)療器械信息，2018，24（4）：7-8.

[3]王俊妨，靳穎，牛偉霞， 等.熒光定量PCR在腦脊液結(jié)核分枝桿菌DNA檢測中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，32（2）：135-137.