五月齡翹嘴紅鲌性腺組織小RNA轉錄譜的分析比較

曹訪　劉莉　采克俊　吳成龍　周俊波

摘要：采用轉錄組高通量測序方法，比較分析幼齡翹嘴紅鲌精巢、卵巢組織中小RNA轉錄譜。結果顯示，精巢、卵巢的小RNA分布的峰值分別為28、29 nt，與一般物種的22～24 nt有較大的差異;在小RNA庫中，經比對注釋的比例很低，分別為2.5%、2.1%。在比對注釋的斑馬魚miRBase、斑馬魚ncRNA、piRNA、Rfam數據庫中，精巢組織中被miRBase數據庫注釋的比例最高，為1.49%;而卵巢組織中被miRBase和piRNA數據庫注釋的比例接近，分別為094%和0.96%。比較表達量相對較高的共有miRNA分子，均是與胚胎發育相關的分子，且大多是精巢組織的表達量高于卵巢組織，這些miRNA分子在個體發育中可能具有重要意義。初步獲得了翹嘴紅鲌不同性腺組織的轉錄譜，為今后進一步分析小RNA在生殖發育中的調控作用奠定了基礎。

關鍵詞：翹嘴紅鲌;精巢;卵巢;miRNA;轉錄譜;分析;比較

中圖分類號： S917.4

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0077-06

收稿日期：2018-10-17

作者簡介：曹 訪（1980—），男，江蘇豐縣人，碩士，高級實驗師，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：hzyzucf@hotmail.com。

生物體內的小分子非編碼RNA通過轉錄和轉錄后調節形成遺傳信息的表達調控網絡，在細胞的分裂分化、個體生長發育和繁殖等生命活動過程中具有重要的作用。已發現的這類小RNA包括siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）、hsRNA（heterochromatin associated small RNA）和piRNA（piwi interacting RNA）等。發掘新的小分子非編碼RNA、研究其生物學功能及作用機制在生命科學研究中具有重要意義，目前研究較多的是miRNA。魚類的miRNA也已在斑馬魚、紅鰭東方鲀等幾個模式種以及非模式魚類的虹鱒魚中被發現報道[1-2]。

miRNAs是一類非編碼、長度約22 nt的小RNA分子，由60～80 nt的莖環前體分子衍生而來，廣泛存在于動物、植物甚至病毒中。miRNAs通過調節靶標mRNAs的穩定性和翻譯效率，在基因的表達中起著非常重要的作用，影響著各個生理過程，包括代謝、細胞凋亡、神經系統發育、免疫防御、腫瘤病理過程等。自從1993年首次在秀麗線蟲中發現miRNA（lin-4）以來[3]，有大量關于miRNAs的生物合成、功能和作用機制的研究[4-6]。盡管miRNAs的作用早已發現，但有關miRNA轉錄組的研究最近幾年才開始。過去主要是通過直接克隆、測序、northern blot雜交分析等鑒定逐個對miRNAs鑒定。但這一方法對于含量較低的、表達水平變化幅度大的、瞬時表達的、與不同發育階段相關的miRNAs的分析具有很大的局限性。這也解釋了小規模測序主要揭示保守miRNAs分子，而對于低水平的非保守miRNAs卻難以分析，高通量測序方法使非保守的、弱表達的、種特異性的miRNAs的分析成為可能。piRNAs是近年來新發現的一類非編碼小RNA，具有組織特異性，調控著生殖細胞和干細胞的生長發育，對物種的遺傳和維持至關重要，已在人、果蠅、斑馬魚等動物的生殖細胞中發現了這類小分子[7-9]。

現有的魚類生殖發育研究主要集中在斑馬魚、青鳉魚等模式物種上，而養殖魚類相關研究甚少，其原因與相關遺傳背景是否清楚有關。但魚類屬低等脊椎動物，物種差異大，其生殖發育復雜多樣，對模式生物的研究成果難以套用到養殖品種中。我國作為水產大國，很多研究者已經認識到這一點。翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）是一種鯉科淡水魚類，分布較為廣泛，俗稱白魚，長江下游俗稱“太湖白魚”，是“太湖三白”之一。其肉質細嫩、營養豐富，是魚中上品，市場價格較高。天然水域的生產量已很低，野生資源日益減少。目前已建立了翹嘴紅鲌的人工繁殖技術和大規模的人工養殖技術。筆者前期的初步研究發現，雌性翹嘴紅鲌的卵巢發育較雄性精巢發育早，其生長也較早。針對這一名優特色魚種開展生殖細胞的基礎生物學研究，對于品種進一步的開發利用及保護天然翹嘴紅鲌的野生資源等都有重要的意義。本研究選取幼齡翹嘴紅鲌的性腺開展了小RNA轉錄組的分析比較，為今后進一步開展生殖細胞發育及性別調控研究等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 組織收集與總RNA制備

分別取5月齡的3尾雌性及3尾雄性翹嘴紅鲌的性腺組織各1 g，迅速在液氮中速凍。研磨后，分別將3尾雌魚和3尾雄魚的組織樣品混合，用TRIzol reagent（Life Technologies公司）試劑提取總RNA。提取的RNA經紫外分光光度計、1%瓊脂糖電泳和Agilent BioAnalyzer 2100進行質檢（安捷倫科技有限公司）。

1.2 小RNA文庫的建立

采用miRNA提取試劑盒mirVanaTM miRNA isolation kit（Ca#t.AM1560 Austin TX，Thermo Fisher，US）從上述提取的總RNA中富集小RNA。之后，先在小RNA的5′和3′末端添加1對接頭序列，再用于接頭互補的序列作為引物進行RT-PCR。擴增的cDNA經6% PAGE膠純化后，使用Qubit 2.0 Fluorometer檢測濃度，Agilent2100檢測文庫的大小。由測序儀Illumina Genome Analyzer GA-IIX（Illumina公司）進行高通量測序。測序質量要求每向堿基質量大于20（Q20）的比例不小于85%。

1.3 生物信息學分析

原始的測序數據以去除低質量讀長以及將含接頭序列且大于18 nt序列為可用的讀長作為數據過濾的依據，所用軟件為CLC genomic workbench（商業軟件版本號5.5）。經過濾的small RNA序列與公共數據庫比對去除rRNA、tRNA、small nuclear RNA（snRNA）and small nucleolar RNA（snoRNA），余下的序列再與miRBase、ncRNA、piRNA、Rfam等數據庫進行比對分析。此外，應用sRNA Toolkit軟件包里的miRCat工具來預測novel miRNA;應用miRanda軟件對miRNA序列以及所測序物種的cDNA序列進行可能的靶位點預測;用DEGseq R語言包結合perl腳本將樣品的表達量進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA制備與小RNA文庫的質量評價

提取精巢和卵巢混合樣品的總RNA的D260 nm/D280 nm分別為2.05和2.02，表明其純度較好。但同樣組織量精巢樣品提取的總RNA量明顯低于卵巢的總RNA提取量，且5S的量較高。推測這可能與雌魚較雄魚發育快有關。此外，Agilent BioAnalyzer 2100質檢結果中RIN值大于8，也表明提取質量合格。

構建的小RNA文庫經Qubit 2.0 Fluorometer檢測，精巢、卵巢的小RNA的cDNA文庫濃度分別為32.6、10.6 ng/μL，主峰長度分別為148、149 bp（圖1）。單端測序，讀長50 nt，測序所用Flow cell為Illumina Single Read Flow cell V4，測序結果顯示精巢和卵巢的Q20值的百分比分別為97.4%和976%，表明測序數據可用于后續的數據分析。

2.2 數據預處理與長度分布統計

本研究采用Illumina/Solexa深度測序技術對幼齡翹嘴紅鲌的精巢和卵巢的小RNA庫進行了測定。應用 CLC genomics_workbench 5.5軟件對測定的數

據進行預處理，主要是棄去僅含接頭序列、低質量序列、長度小于15 nt和大于33 nt的序列等。此外，還須排除已知的mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和重復序列元件。測定的精巢小RNA原始讀長（reads）為24 752 792個，可用于后續分析的高質量有效讀長20 167 240個，占81.47%;卵巢小RNA的原始讀長為 22 947 949 個，其中有效讀長為18 198 879個，占79.31%。精巢小RNA的序列大小分布的峰值在28 nt，卵巢小RNA的峰值在29 nt（圖2）。

2.3 比對注釋，鑒定已知miRNA

上述處理后的序列與最新Sanger miRBase數據庫比對，比對過程不允許有錯配。另外還與其他非編碼數據庫ncRNA、piRNA、Rfam數據庫比對，允許與目標序列有2個堿基錯配、允許比目標序列兩端各縮短或延長2個堿基。比對結果（圖3）表明，精巢的有效讀長序列中，被注釋的讀長有502 823個，占2.5%，其中與斑馬魚miRBase、斑馬魚ncRNA、piRNA、Rfam數據庫比對注釋的讀長所占比例分別為 1.49%、0.87%、0.09%、0.05%;而卵巢組織中被注釋的讀長有374 895個，占2.1%，被上述數據庫注釋的比例分別為0.94%、0.10%、0.96%、0.07%。

用DEGseq R語言包結合perl腳本將精巢和卵巢樣品的表達量進行鑒定和比較分析。2個樣品的小RNA中，有219個miRNA與斑馬魚miRBase已知miRNA相同，但其表達量有差異。其中有9個miRNA在精巢組織中可找到，在卵巢中沒有找到;有4個在卵巢中有而在精巢中沒有，但這13個miRNA的表達豐度都極低。在已知miRNA中，較高表達豐度的miRNA分子在精巢中的表達絕大部分都高于卵巢（圖4）。

2.4 新microRNA分子的預測

應用sRNA Toolkit軟件包中的miRCat工具來預測novel miRNA。microRNA前體的標志性發卡結構能夠用來預測新的microRNA。將沒有注釋的讀長（樣品名_unannotated.csv）比對到斑馬魚基因組后，通過折疊模型分析，若有序列位于莖環結構上，則初步判定該序列為1個候選的新microRNA。按上述方法在精巢組織中預測到76個新microRNA，卵巢組織中預測到77個，其中50個相同。預測新microRNA序列，見表1。在這些預測的新microRNA分子中，僅在精巢和卵巢共有序列中有4個序列具有對應的miRNA*序列，分別是第1、第2、第30號序列，它們對應的miRNA*序列分別為：AUGAAGGUCAAUGGUUAvCCvAGU（dre-miR-7146-3p）、GAUCAUUUUUGUGAUUAUGCAGCU（dre-miR-153c-3p）、UCACAGUGAACCGGUCUCUUUU（dre-miR-128-3p）。

3 討論

魚類養殖中所涉及的苗種繁育、性別控制等問題與魚類生殖細胞的發育分化密切相關。此外，魚類屬低等脊椎動物，其生殖發育較高等脊椎動物具有更豐富的多樣性。結合現代生命科學技術，弄清楚水產養殖魚類的基礎生物學問題，是進行現代育種、建設現代漁業的重要環節。本研究就具有地方特色的名優水產養殖品種翹嘴紅鲌的性腺小RNA轉錄譜進行了初步的分析。筆者在研究中發現，盡管筆者所用材料均為5月齡翹嘴紅鲌性腺，但通過組織切片觀察其性腺發育階段明顯不同。該階段精巢組織中還未見游離精子，而卵巢組織中已見游離的卵子;提取總RNA時也發現，卵巢組織總RNA中5S RNA的含量很高。目前，已有翹嘴紅鲌全雌育種技術的應用，主要是利用雌性生長較雄性快的特點，從其性腺的發育來看，也是雌性發育較雄性早。

從獲得的小RNA數據與現有數據庫比對結果來看，可注釋的序列比例非常低，97%以上的序列無法注釋，這一方面反映了魚類基因組信息的多樣性，另一方面也提示模式生物的遺傳信息對于魚類基因組、轉錄組等研究具有較大的局限性。在小RNA序列分布中，發現其峰值在28～29 nt，這一值較其他物種明顯偏高。已報道的其他物種小RNA大小分布的峰值一般在22～24 nt，也有報道在 26 nt[10]。仔細校驗測序過程，證實其樣品制備及測序質控均符合要求，說明該結果與物種有關。但是否因其特殊的發育階段導致，還須與其他發育階段的小RNA轉錄組比較。

在被注釋的已知miRNA中，miR-181a-5p、mir-143-1、mir-92a-1、mir-26a-1、miR-146a、mir-10b-1、mir-22a、mir-21-1、mir-10c、let-7a-1等這些表達量較高的miRNA分子，均與斑馬魚的個體發育密切相關[11-12]。此外，在小RNA轉錄譜已比對注釋的分子中，精巢miRNAs所占比例最高，為1.49%，而卵巢中已注釋的miRNAs和piRNAs所占比例接近，分別為0.94%和0.96%，這可能也與同一年齡的精巢和卵巢組織實際上是處于不同的發育階段有關，其中miRNAs和piRNAs的消長規律值得進一步探討。

4 結論

本研究采用轉錄組高通量測序方法，比較分析了幼齡翹嘴紅鲌精巢和卵巢組織中小RNA轉錄譜，由于沒有翹嘴紅鲌基因組信息，新miRNA的預測只能以斑馬魚基因組信息為基礎展開。結果顯示，部分預測的同一個新miRNA分子位于不同的染色體上，由此推測這些成熟的miRNA分子在翹嘴紅鲌的基因組中也可能對不同的基因起到調控作用。下一步，筆者可繼續比較分析其他不同發育階段性腺小RNA轉錄譜，可能找出性別調控的關鍵miRNAs或piRNAs。

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