黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑對人肺癌A549細胞增殖及E-cadherin、Snail1表達的影響

王曉芳 于丹 劉春英

[摘要]目的 研究黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑對人肺癌A549細胞的作用及其對E-cadherin、Snail1表達的影響。方法 黃芪建中湯含藥血清聯合不同濃度順鉑（0、2、4、8、16、32、64 μg/ml）培養A549細胞株48 h，采用四唑鹽比色（MTT）法檢測細胞株的增殖抑制率，確定聯合順鉑的最佳用藥濃度。將A549細胞株隨機分為4組，即空白組、中藥組、順鉑組、聯合組，依次用完全培養基、黃芪建中湯含藥血清、順鉑、黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑干預。各組細胞株培養48 h后，進一步采用MTT法檢測各組細胞株的增殖抑制率。再通過免疫細胞化學法（IHC）、免疫蛋白印跡（WB）法檢測各組細胞株E-cadherin、Snail1蛋白的表達。最后通過實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測各組細胞株E-cadherin、Snail1基因的表達。結果 MTT法研究顯示，聯合用藥時順鉑的最佳濃度為8 μg/ml;聯合組A549細胞株增殖抑制率高于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統計學意義（P<0.05）。IHC和WB法研究顯示，聯合組A549細胞株中的E-cadherin蛋白表達水平高于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;聯合組A549細胞株中的Snail1蛋白表達水平低于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統計學意義（P<0.05）。RT-PCR法研究顯示，聯合組A549細胞株中的E-cadherin基因表達水平高于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;聯合組A549細胞株中的Snail1基因表達水平低于順鉑組、中藥組、空白組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑能夠抑制A549細胞株的增殖，增強人肺癌A549細胞株中E-cadherin蛋白、基因的表達，并降低人肺癌A549細胞株中Snail1蛋白、基因的表達。

[關鍵詞]肺癌;A549細胞;黃芪建中湯;順鉑;E-cadherin;Snail1

[中圖分類號] R273? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）4（a）-0004-06

[Abstract] Objective To study the effect of serum containing Huangqi Jianzhong Decoction combined with Cisplatin on A549 cell proliferation and expression of E-cadherin and Snail1 in human lung cancer. Methods A549 cell lines were cultured for 48 h with the serum containing Huangqi Jianzhong Decoction combined with different concentrations of Cisplatin （0， 2， 4， 8， 16， 32， 64 μg/ml）. Magnetic Tape Terminal （MTT） was used to detect the proliferation inhibition rate of A549 cell lines and determine the optimal concentration of Cisplatin. A549 cell lines were randomly divided into four groups： blank group， traditional Chinese medicine group， Cisplatin group and combination group， in which complete medium， serum containing Huangqi Jianzhong Decoction， Cisplatin， serum containing Huangqi Jianzhong Decoction and Cisplatin were successively used for intervention. After A549 cell lines were cultured for 48 h， the proliferation inhibition rate of A549 cell lines in each group was further detected by MTT. The protein expression levels of E-cadherin and Snail1 in each group were determined by immunohistochemistry （IHC） and Western Blot （WB）. The gene expression levels of E-cadherin and Snail1 were determined by realtime-PCR （RT-PCR）. Results The research of MTT method showed that the optimal concentration of Cisplatin in combination was 8 μg/ml. The inhibition rate of A549 cell lines in the combination group was higher than that in the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The research of IHC and WB method showed that the expression level of E-cadherin protein of A549 cell lines in the combination group was higher than that in the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， the differences were statistically significant （P<0.05）. And the expression level of the Snail1 protein of A549 cell lines in the combination group was lower than that in the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， with statistically significant differences （P<0.05）. The research of RT-PCR method showed that the gene expression level of E-cadherin of the A549 cell lines in the combination group was higher than that in the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， with statistically significant differences （P<0.05）. The gene expression level of the Snail1 in the A549 cell lines of the combination group was lower than that of the Cisplatin group， the traditional Chinese medicine group and the blank group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Serum containing Huangqi Jianzhong Decoction combined with Cisplatin can inhibit the proliferation of A549 cell lines， enhance the expression of E-cadherin protein and gene in A549 cells line of human lung cancer， and reduce the expression of Snail1 protein and gene in A549 cells line of human lung cancer.

[Key words] Lung cancer; A549 cells; Huangqi Jianzhong Decoction; Cisplatin; E-cadherin; Snail1

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年約一百萬人死于肺癌，其中約80%的肺癌患者死于侵襲和轉移[1-2]。由于肺癌早期癥狀不明顯，大多數患者在接受治療時，已經處于中晚期以致錯失手術最佳治療時期，肺癌治療方案有外科手術、放射療法、化學治療、靶向治療，其中靶向治療是其主要的治療方法之一[3-4]。靶向治療能夠有效延長患者的壽命，但其創傷大，造成患者免疫力降低，嚴重影響患者的生存質量，因此探究肺癌發生發展的機制以及新的治療方法成為新趨勢[5-6]。肺癌晚期患者，有消瘦、乏力、精神萎靡、倦怠的脾虛癥狀，說明“脾氣虛”對肺癌發展有重要影響，其治療當以培補脾氣為本[7-9]。現代醫學研究表明，黃芪建中湯可通過其益氣健脾作用來改善機體的免疫功能，從而抑制腫瘤的發生及發展[4]，對中醫藥改善腫瘤微環境影響的機制研究具有重要意義。前期實驗研究表明，順鉑可以抑制A549細胞的增殖轉移，黃芪建中湯含藥血清可以抑制A549細胞增殖轉移[5]。本研究通過檢測藥物對A549細胞增殖抑制率的影響及檢測細胞內E-cadherin、Snail1蛋白和基因的表達水平，探討黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑抑制人肺癌A549細胞的增殖作用及其機制，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

1.1.1細胞株? 人肺癌A549細胞株購自于中國醫學科學院基礎醫學研究所。

1.1.2主要實驗試劑與儀器? 胎牛血清（S-FBS-015）購于SERANA公司;0.25%胰蛋白酶（SH30042.01）購于HyClone公司;雙抗（SV30010）購于HyClone公司;RPMI-1640培養基（SH30809.01）購于HyClone公司;PBS（AC13716274）購于HyClone公司;順鉑粉劑（Y27N8C49197）購于上海源葉生物科技有限公司;四唑鹽比色（MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（M1020）購于Solarbio有限公司;免疫組化試劑盒SABC即用型（SA1020）購于博士德生物技術有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒（PC0020）購于Solarbio有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（P1200）購于Solarbio有限公司;TBS緩沖液（BL602A）購于biosharp公司;Tween-20（T8220）購于Solarbio有限公司;M5 Total RNA Extraction Reagent（MF034-01）購于Mei5有限公司;β-actin（A01010）、E-cadherion（ABP51221）和Snail1（ABP52472）抗體購于Abbkine有限公司;水平搖床（TDK-2）購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;酶標儀（ELX800）購于美國伯騰儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1 A549細胞培養及實驗分組處理? 人肺癌A549細胞株在37℃、濕度95%、5% CO2的恒培養箱中培養，RPMI-1640培養基培養液中含15%胎牛血清、1%雙抗，2 d換液，3 d 0.25%胰酶進行消化并傳代。待A549細胞貼壁生長密度達到70%后，將其隨機分為4組：空白組（A549+完全培養基）、中藥組（A549+黃芪建中湯含藥血清）、順鉑組（A549+順鉑）、聯合組（A549+黃芪建中湯含藥血清+順鉑）。本實驗室前期研究發現，黃芪建中湯最佳濃度含藥血清為含生藥1.148 kg/ml，最佳作用時間為48 h[5]。

1.2.2 MTT法檢測A549細胞株的抑制率? 將對數期生長的A549細胞去除培養基，0.25%胰酶、37℃消化5 min，制成單細胞懸液105/ml，接種于96孔板，細胞貼壁后，分別用完全培養基（空白組）和濃度為0、2、4、8、16、32、64 μg/ml的順鉑聯合黃芪建中湯含藥血清處理，每組設5個復孔，培養箱中培養48 h后取出，吸去上清，每孔加20 μl的MTT溶液，37℃培養4 h后，去除廢液，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），水平搖床避光震蕩10 min，酶標儀490 nm測量吸光度（OD）值（A），選出聯合用藥中最適順鉑濃度。根據常用公式：細胞生長抑制率（IR，%）=[1-（實驗組A平均值-空白對照組A均值）/（細胞對照組A均值-空白對照組A均值）]×100%[4]。以上實驗重復3次。

1.2.3免疫細胞化學（immunohistochemistry，IHC）法檢測E-cadherin、Snail1蛋白的表達? 細胞鋪片，根據實驗分組給予相應的處理因素培養48 h后取出，室溫固定、通透，3% H2O2室溫孵育10 min，5% 牛血清清蛋白（BSA）封閉，實驗組分別加入一抗[E-cadherin（1∶200稀釋）和Snail1（1∶200稀釋）]4℃過夜，次日，生物素化二抗10 min，鏈霉菌抗生素-過氧化物酶處理10 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-pro Plus 6.0軟件進行分析。

1.2.4免疫蛋白印跡（Weatern Blot，WB）法檢測E-cadherin、snail1蛋白的表達? 取出根據實驗分組給予相應的處理因素培養48 h后的細胞培養瓶，用預冷的PBS清洗后，加細胞裂解液100 μl反復吹打使其充分接觸細胞，收集細胞裂解產物，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA蛋白濃度測定，100℃變性5 min，-20℃保存待用。灌制SDS-聚丙烯酰胺凝膠、上樣、電泳、轉印液轉膜后，立春紅染液檢驗，TBST清洗10 min，封閉液封閉2 h，一抗[E-cadherin（1∶800稀釋）和Snail1（1∶800稀釋）]4℃孵育過夜，二抗室溫水平震蕩1 h，TBST清洗10 min，配置熒光顯色劑，Tanon凝膠成像系統進行曝光。用AlPhaview SA軟件測量各個條帶的吸光度值，進行統計分析。

1.2.5實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測E-cadherin和Snail1基因的表達? 引物由武漢金開瑞生物工程有限公司設計，所用的引物序列如下。E-cadherin上游引物：5′-TCAAGGTGAGGGGTTAAGCAC-3′，下游引物：5′-CGACGTTAGCCTCGTTCTCA-3′;snail1上游引物：5′-CCAGACCCACTCAGATGTCA-3′，下游引物：5′-GGACTCTTGGTGCTTGTGGA-3′;β-actin上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′。取出根據實驗分組給予處理因素培養48 h后的細胞培養瓶，分別提取各組A549細胞株的總RNA（按照M5 TotalRNA Extraction Reagent提取步驟），檢測樣本RNA的濃度，計算RNA濃度（μg/μl）=OD260×40×稀釋倍數/1000。合成cDNA按照逆轉錄試劑盒的說明，反應條件為37℃ 15min，98℃ 5 min，一個循環。PCR擴增的反應條件為95℃ 1 min，一個循環;95℃ 15 s，60℃ 45 s，共40個循環;95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。7500RT-PCR系統檢測，計算相對值（ratio）=2-△△CT。

1.3觀察指標

檢測黃芪建中湯含藥血清聯合不同濃度順鉑對人肺癌A549細胞OD值并計算細胞株的增殖抑制率。通過轉錄水平和翻譯水平檢測黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑作用于A549細胞株時，E-cadherin蛋白、基因的表達以及Snail1蛋白、基因的表達。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1黃芪建中湯含藥血清聯合不同濃度順鉑對A549細胞增殖的影響

采用MTT法檢測黃芪建中湯含藥血清（生藥量為1.148 kg/ml）中聯合不同濃度的順鉑對A549細胞增殖的影響，結果見圖1，當順鉑濃度達到8 μg/ml時，對A549細胞株增殖的抑制作用達最佳效果，因此本實驗采用8 μg/ml的順鉑作為聯合給藥組用藥濃度。進一步檢測結果顯示，中藥組[（8.11±6.78）%]、順鉑組[（18.35±1.03）%]和聯合組[（18.84±4.47）%]對A549細胞株的抑制率均高于空白組[（0.00±0.00）%]，差異有統計學意義（P<0.05）;順鉑組對A549細胞株的抑制率高于中藥組，差異有統計學意義（P<0.05）;聯合組對A549細胞株的抑制率高于中藥組，差異有統計學意義（P<0.05）;聯合組對A549細胞株的抑制率高于順鉑組，差異有統計學意義（P<0.05）。提示本實驗中黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞株增殖有抑制作用，為后續實驗提供有力理論依據。

2.2 IHC法檢測各組A549細胞株中E-cadherin、Snail1蛋白表達的情況

各組細胞中E-cadherin陽性表達多在細胞膜[10]，Snail1陽性多表達在細胞質[11]，呈棕黃色顆粒著色。聯合組、順鉑組、中藥組A549細胞株中的E-cadherin蛋白表達水平均高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;聯合組、順鉑組A549細胞株中的E-cadherin蛋白表達水平均高于中藥組，差異有統計學意義（P<0.01）;聯合組A549細胞株中的E-cadherin蛋白表達水平高于順鉑組，差異有統計學意義（P<0.01）（圖2，封三、表1）。聯合組、順鉑組、中藥組A549細胞株中的Snail1蛋白表達水平均低于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;聯合組、順鉑組A549細胞株中的Snail1蛋白表達水平均低于中藥組，差異有統計學意義（P<0.01）;聯合組A549細胞株中的Snail1蛋白表達水平低于順鉑組，差異有統計學意義（P<0.01）（圖3，封三、表1）。

2.3 WB法檢測各組A549細胞株中E-cadhern、Snail1蛋白表達的情況

中藥組、順鉑組和聯合組A549細胞株中的E-cadherin蛋白表達水平均高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;順鉑組和聯合組A549細胞株中的E-cadherin蛋白表達水平均高于中藥組，差異有統計學意義（P<0.01）;聯合組A549細胞株中的E-cadherin蛋白表達水平高于順鉑組，差異有統計學意義（P<0.01）。中藥組、順鉑組和聯合組A549細胞株中的Snail1蛋白表達水平均低于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;順鉑組和聯合組A549細胞株中的Snail1蛋白表達水平均低于中藥組，差異有統計學意義（P<0.05）;聯合組A549細胞株中的Snail1蛋白表達水平低于順鉑組，差異有統計學意義（P<0.01）（圖4、表2）。

2.4 RT-PCR法檢測各組A549細胞株中E-cadherin、Snail1基因表達情況的比較

中藥組、順鉑組和聯合組A549細胞株中的E-cadherin基因表達水平均高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;順鉑組和聯合組A549細胞株中的E-cadherin基因表達水平均高于中藥組，差異有統計學意義（P<0.01）;聯合組A549細胞株中的E-cadherin基因表達水平高于順鉑組，差異有統計學意義（P<0.01）。中藥組、順鉑組和聯合組A549細胞株中的Snail1基因表達水平均低于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;順鉑組和聯合組A549細胞株中的Snail1基因表達水平均低于中藥組，差異有統計學意義（P<0.01）;聯合組A549細胞株中的Snail1基因表達水平低于順鉑組，差異有統計學意義（P<0.01）（表3）。

3討論

中國傳統醫學古籍中并沒有對“肺癌”這一病名的記載，現代中醫學認為，肺癌涵蓋在中醫的“肺積”“肺脹”“痞疪”等疾病之中，是一種多因脾氣不足、正氣虧虛所致的疑難之病。中藥具有作用靶點多、不易耐藥的特點，可以調節肺癌免疫，其機制包括增強細胞毒性、T細胞、巨噬細胞等細胞的免疫監視與殺傷作用[12]，在臨床診治中被許多醫家推崇應用進行治療肺癌。黃芪建中湯作為“培土生金法”的代表方之一，由黃芪、桂枝、芍藥、炙甘草、生姜、大棗、飴糖組成。方中黃芪入肺、脾二經，合甘草、大棗補益脾氣，桂枝、生姜溫陽散寒，白芍緩急止痛，飴糖補脾緩急，各藥合用功能在于燮理陰陽，培補脾氣，是益氣健脾的代表方之一，可以有效改善消瘦、倦怠、乏力、精神萎靡等脾氣虛癥狀。現代研究表明，益氣法可延長生存期、預防遠處轉移、抑制腫瘤增殖[13]。黃芪的提取物具有廣泛的抗癌作用，其中，作為重要提取成分之一的黃芪多糖能夠抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生長，進而增強小鼠T淋巴細胞的抗腫瘤免疫活性[4]，為中醫在癌癥的診斷與治療方面提供理論依據。

上皮-間質轉化（eithelial-mesenchymal transformation，EMT）是由某些生理或病理條件下引起的上皮細胞向間充質細胞轉化的分化過程，其在胚胎組織分化、傷口愈合、組織纖維化和癌癥進展中起著重要作用，是惡性腫瘤侵襲轉移的重要標志之一[14-15]，現代醫學研究表明，通過改善EMT可以有效減少腫瘤的復發和轉移[16-17]。廣泛分布于上皮細胞的E-cadherin可以促進細胞黏附聚集，維持上皮細胞的完整形態，也是外部信號傳導進入細胞內骨架的樞紐，對腫瘤細胞的接觸性依賴性生長起到抑制的功能。實驗研究表明，降低或消除E-cadherin蛋白表達與腫瘤的進展、侵襲和預后不良有關[18]。Snail基因編碼Snail家族鋅指蛋白1，以鋅指轉錄因子1即Snail1著稱[6]，Snail1在腫瘤細胞中會促進上皮細胞鈣黏蛋白降解，促進腫瘤細胞的侵襲轉移[19-20]。近年來研究發現，Snail是誘導EMT的主要轉錄因子，在腫瘤發生過程中，腫瘤細胞在腫瘤和宿主之間的轉移和浸潤，主要由炎癥細胞因子通過Snail誘導EMT引起[6-7，21]。在組織或器官纖維化等疾病的EMT過程受多種機制調控，Snail1是其進程中的關鍵性調控因子。它能夠與轉錄因子超家族成員有效結合，并且通過與E-box結合來直接抑制E-cadherin基因的表達，使得E-cadherin蛋白在上皮細胞的表達減少，在形態學上上皮細胞失去了極性，細胞之間的黏附作用降低，從而使腫瘤細胞呈現易轉移和易侵襲狀態[19-20]。E-cadherin和Snail1作為EMT發生的經典標志物，研究提示發生EMT時，都伴隨著E-cadherin蛋白表達的下調和Snail1蛋白表達的上調，逆轉EMT的發生時，一般都伴隨著E-cadherin蛋白表達的升高及Snail1蛋白表達的下調[6-9]。

本實驗對黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑干預人肺癌A549細胞株進行研究，結果顯示，黃芪建中湯含藥血清聯合的順鉑最佳濃度為8 μg/ml，聯合用藥時人肺癌A549細胞株的增殖抑制作用增強，E-cadherin蛋白、基因表達增高，Snail1蛋白、基因表達降低。提示黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑可以有效緩解肺癌細胞的增殖轉移，但其具體作用機制還需進一步研究。

綜上所述，黃芪建中湯含藥血清聯合順鉑能夠抑制A549細胞株的增殖，增強人肺癌A549細胞株中E-cadherin蛋白、基因的表達，并降低人肺癌A549細胞株中Snail1蛋白、基因的表達。

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（收稿日期：2019-11-19? 本文編輯：任秀蘭）