三萜纖細薯蕷皂苷對人肝癌HepG2細胞的抑制作用研究

付康 隋廣超 史金銘

【摘要】目的 探討屬于三萜類化合物的纖細薯蕷皂苷對人肝癌HepG2細胞生物學功能的影響及潛在臨床應用價值。方法 采用CCK8試劑盒檢測纖細薯蕷皂苷對HepG2細胞活性的影響，流式細胞儀檢測細胞凋亡，蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達變化。結果 HepG2細胞的細胞活性隨著纖細薯蕷皂苷的濃度升高而降低;纖細薯蕷皂苷在逐漸增加的濃度下處理HepG2細胞，隨著纖細薯蕷皂苷濃度的升高，HepG2細胞的總凋亡率逐漸增加;與經DMSO溶劑處理的對照組細胞相比，經纖細薯蕷皂苷處理后的HepG2細胞內PARP蛋白切割，caspase 3激活和BCL2表達水平降低。結論 纖細薯蕷皂苷可能通過下調BCL2蛋白表達抑制HepG2細胞的增殖和誘導凋亡。

【關鍵詞】纖細薯蕷皂苷;肝癌HepG2細胞;細胞凋亡;BCL2

【中圖分類號】R735.7 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2020.1..02

原發性肝癌由于其起病隱匿，早期癥狀不明顯且發展迅速，致使確診時在大多數患者體內已發生遠端轉移，使得治療難度增加，預后性差，這導致肝癌成為致死率最高的惡性腫瘤之一[1]。隨著近些年分離純化和化學合成技術的發展，許多具有抗癌活性的天然小分子化合物得以被分離或合成。纖細薯蕷皂苷是一種三萜類化合物，在薯蕷科植物中含量較為豐富[2]。既往研究已報道薯蕷皂苷及其衍生物具有抗腫瘤活性[2-4]，但目前相關研究仍較少，且其對肝癌細胞生物學功能影響及價值仍不清楚。本研究以纖細薯蕷皂苷作用于人肝癌細胞系HepG2，探討其對肝癌細胞的細胞增殖和細胞凋亡的作用，并通過蛋白質印跡法檢測與細胞凋亡相關的蛋白表達，為纖細薯蕷皂苷抑制肝癌分子機制和臨床價值的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1? 細胞株及主要試劑

來源于人的肝癌細胞株HepG2購買于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所;CCK-8試劑盒購買于MedChem Express公司;凋亡試劑盒購買于南京諾唯贊生物科技有限公司;各種蛋白抗體均購買于Cell Signaling Technology公司;纖細薯蕷皂苷購買于美國Target Molecule公司。

1.2? CCK-8法檢測細胞存活率實驗

將處于對數生長期且細胞狀態良好的HepG2細胞，以3×104個/mL的密度，100L/孔接種于96孔細胞培養板中過夜培養24 h。纖細薯蕷皂苷實驗組分別加入100L溶于MEM培養液的終濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mol/L的纖細薯蕷皂苷溶液，對照組加入100 L與實驗組依次對應等DMSO濃度的MEM溶液，每組均設3個復孔，培養48h后，每孔加入10 L CCK-8溶液，另取三個孔不鋪細胞，只加100L MEM培養液和10L CCK-8溶液作為空白對照，在培養箱中孵育3h，用酶標儀檢測426nM處的吸光度，計算細胞存活率。

細胞存活率=[（A纖細薯蕷皂苷實驗組-A空白對照組平均值） / （ADMSO對照組平均值-A空白對照組平均值）] × 100%。

1.3? 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將HepG2細胞以3×106個/mL的密度，1.5 mL/孔接種于6孔細胞培養板中過夜培養24h。纖細薯蕷皂苷實驗組分別加入溶于MEM培養液的終濃度為5、7.5、10、15、20mol/L的纖細薯蕷皂苷溶液，對照組加入與20 mol/L的纖細薯蕷皂苷溶液等DMSO濃度的MEM溶液，處理24 h后收集細胞，將細胞重懸于100 L 1×Binding Buffer，并加入5 L Annexin V-FITC和5 L PI Staining Solution，輕輕吹勻至單細胞懸液，室溫、避光，孵育10 min后加入400 L 1×Binding Buffer，輕輕混勻。染色后樣品在1 h內用流式細胞儀在488 nm和530 nm激發波長下進行檢測。晚期凋亡細胞數與總細胞數的比值為細胞晚期凋亡率。實驗重復4次。

1.4? Western blot檢測蛋白表達

將HepG2細胞以3×105個/mL的密度，3 mL/板接種于6 cm細胞培養板中過夜培養24bh。實驗組用溶于MEM培養液的終濃度為5、10 mol/L的纖細薯蕷皂苷溶液，對照組加入與10 mol/L的纖細薯蕷皂苷溶液等DMSO比例的MEM溶液，處理24 h后收集細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白。采用Bradford法鑒定蛋白濃度，取20 ug蛋白上樣，經SDS-PAGE，轉膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h。分別用抗體PARP、cleaved PARP、caspase 3、GAPDH、BCL2進行4°C過夜孵育。用TBST洗膜3次，再加入二抗，室溫孵育1h。用TBST洗膜4次。膜經ECL超敏發光液顯色后進行成像。

1.5? 統計學分析

采用GraphPad Prism 8進行統計學分析，實驗數據以“x±s”表示。以P<0.05為有統計學差異。

2 結 果

2.1? 纖細薯蕷皂苷對 HepG2 細胞增殖的影響

纖細薯蕷皂苷在3mol/L時對HepG2的生長有明顯抑制作用。隨著纖細薯蕷皂苷濃度的增加，HepG2細胞活力逐漸降低，呈現明顯的濃度與抑制率正相關性，其IC50為4.105M。見圖一。

2.2? 纖細薯蕷皂苷誘導HepG2細胞凋亡

隨著纖細薯蕷皂苷處理的濃度的升高，使HepG2發生晚期凋亡的細胞比例也逐漸上升。HepG2細胞在5、7.5、10、15和20 mol/L纖細薯蕷皂苷處理24 h后，晚期凋亡率分別為（3.1925%±0.156）%、（10.525%±0.287）%、（31.65%±0.420）%、（62.325%±1.282）%和（72.725%±1.903）%。見圖二。

2.3? PARP、cleaved PARP、caspase 3、BCL2蛋白水平的變化

Western blot結果顯示，與對照組相比，HepG2細胞在10 mol/L纖細薯蕷皂苷處理24 h后，細胞內PARP蛋白水平下降，cleaved PARP蛋白水平升高說明PARP蛋白在體內被切割;caspase 3和BCL2蛋白水平均有下降，說明藥物誘導肝癌細胞發生了凋亡。見圖三。

3 討 論

纖細薯蕷皂苷是一類在薯蕷科植物中含量豐富的薯蕷皂苷類化合物。前人曾報道薯蕷皂苷及其類似物對部分腫瘤細胞有抑制作用[5]，但其對肝癌細胞生物學功能影響尚不清楚。本研究針對纖細薯蕷皂苷，探究了其對人肝癌細胞的促凋亡作用及其分子機制。

BCL2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在調節細胞凋亡中有重要作用。其中BCL2屬于BCL2家族中的抗凋亡蛋白，其定位于細胞核膜、內質網膜和線粒體外膜上，直接影響線粒體膜功能。BCL2可通過BH3結構域與同家族的促凋亡蛋白結合，從而形成異源二聚體，以此維持促凋亡蛋白在細胞內的定位分布。若BCL2蛋白的含量相對下降，BCL2家族的促凋亡蛋白將移位到線粒體膜上，刺激線粒體釋放促凋亡因子，激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡[6， 7]。Caspase 3作為caspase級聯反應下游最關鍵的凋亡執行者之一，活化后的caspase 3能切割PARP蛋白，從而影響DNA的復制及損傷修復[8]。

本研究結果表明，與對照組相比，經過纖細薯蕷皂苷處理后，HepG2細胞內的BCL2蛋白含量相對減少，說明纖細薯蕷皂苷很可能直接或者間接的作用于BCL2蛋白上導致其蛋白表達的下降，從而激活caspase級聯反應。Caspase 3蛋白水平的下降，表明有caspase 3 被切割而激活，同時，PARP蛋白也被切割，這些現象說明caspase級聯反應已進行到了效應階段。隨著纖細薯蕷皂苷處理濃度的升高，HepG2細胞的存活率逐漸下降，發生晚期凋亡的細胞占比也在升高，說明纖細薯蕷皂苷能抑制人肝癌HepG2細胞的增殖并誘導其發生凋亡。

綜上所述，纖細薯蕷皂苷表現出的抗腫瘤活性，使其可能作為抗腫瘤藥物的主要成分而被開發利用，有望為肝癌的臨床治療提供新的方法。

參考文獻

[1] 呂桂帥，陳 磊，王紅陽.我國肝癌研究的現狀與前景[J].生命科學，2015，27（03）：237-48.

[2] 陸禮和，吳德松，彭玲芳，et al.纖細薯蕷皂苷衍生物及其抗腫瘤活性研究 [J].云南大學學報（自然科學版），2015，37（03）：415-21.

[3] 羅卓瑪，胡越高，王璐紅，et al.薯蕷皂苷元抗腫瘤衍生物的合成及其生物活性的研究[J].有機化學，2018，38（04）：919-25.

[4] MIN H Y，JANG H J，PARK K H，et al.The natural compound gracillin exerts potent antitumor activity by targeting mitochondrial complex II [J].Cell Death Dis，2019，10（11）： 810.

[5] 王麗娟，王 巖，陳聲武，et al.薯蕷皂苷元體內、外的抗腫瘤作用[J].中國中藥雜志，2002，10）：60-2.

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[7] 楊連君.bcl-2，bax與腫瘤細胞凋亡[J].中國腫瘤生物治療雜志，2003，（03）：232-4.

[8] 岳原亦，張 揚，張一奇.Caspase家族與細胞凋亡[J].中國醫療前沿，2011，6（06）：25-6.

本文編輯：李 豆