血清miR-122和miR-199a對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的診斷價(jià)值分析

王悅菲 蔡蓉 何琳△ 胡濤

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二人民醫(yī)院婦科,江蘇 無(wú)錫 214000；2.南京市婦幼保健院婦科,江蘇 南京 210000)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種慢性婦科疾病，是指有活性的內(nèi)膜細(xì)胞種植在子宮內(nèi)膜以外的位置而形成的一種女性常見(jiàn)婦科疾病[1]。5%～10%的育齡婦女存在子宮內(nèi)膜異位癥，其中有80%的患者甚至影響到生育問(wèn)題[2]。目前子宮內(nèi)膜異位癥確診金標(biāo)準(zhǔn)是腹腔鏡，這是一種高度侵入性的操作，存在許多潛在的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此在不影響病人治療的前提下要盡量避免腹腔鏡手術(shù)，就有必要尋找可靠的非侵入性診斷方法來(lái)診斷該疾病。miRNA有重要的靶基因[4]，其表達(dá)也影響子宮內(nèi)膜異位癥等多種生理和病理狀態(tài)。正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中幾種miRNA及其靶基因的表達(dá)存在差異[5]，而微陣列分析可以檢測(cè)這些miRNA在子宮內(nèi)膜中的差異表達(dá)[6]。因此miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥患者中的差異表達(dá)，通過(guò)血清中循環(huán)miRNA的檢測(cè)可能具有較高的診斷價(jià)值[7]。子宮內(nèi)膜異位癥婦女的炎癥標(biāo)志物的測(cè)定還沒(méi)有明確的研究結(jié)論。除了miRNA水平，一些研究還證實(shí)患病婦女和健康婦女之間的血清白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)之間沒(méi)有差別，而有研究報(bào)告指出在子宮內(nèi)膜異位癥婦女中IL-6水平較高[8]。子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物如果能在血液或其他體液中檢測(cè)，如腹膜液、月經(jīng)和子宮內(nèi)膜液，將極大降低子宮內(nèi)膜異位癥患者診斷的難度。本研究的目的是評(píng)價(jià)血清和腹膜液的miR-122、miR-199a和IL-6作為診斷子宮內(nèi)膜異位癥的可靠無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物的效能。報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月在我科住院的患者共計(jì)150例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有盆腔子宮內(nèi)膜異位癥，經(jīng)腹腔鏡診斷并經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)的患者。(2)對(duì)照組的對(duì)象是因盆腔疼痛、不孕癥或良性腫瘤接受腹腔鏡手術(shù)但未被診斷為子宮內(nèi)膜異位癥的婦女。排除標(biāo)準(zhǔn):在腹腔鏡手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)因子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜息肉、慢性或急性炎癥疾病、傳染病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病等接受過(guò)藥物治療的患者。

1.2方法

1.2.1所有參與者都接受了完整的檢查，包括月經(jīng)模式的評(píng)估、全身和腹部檢查、局部盆腔檢查以及腹腔鏡檢查子宮內(nèi)膜異位癥的存在與否。

1.2.2手術(shù)前，在卵泡期(5～10 d)采集血液樣本：樣本在37 ℃下孵育15 min，離心15 min分離血清，-80 ℃保存。測(cè)定白細(xì)胞介素-6、miR-122和miR-199a水平，在腹腔鏡檢查時(shí)抽取腹腔積液：離心20 min取腹腔液中的細(xì)胞成分，在-80 ℃下保存上清液，測(cè)定IL-6、miR-122和miR-199 a水平，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定白細(xì)胞介素-6的濃度。

1.2.3RNA的提取是使用mirVana Paris Kit進(jìn)行，含RNA的洗脫液在-20 ℃保存。

1.2.4通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析，定量實(shí)時(shí)檢測(cè)miR-122和miR-199 a的表達(dá)。以U6 RNA為內(nèi)源對(duì)照，在42 ℃下處理20 μL RNA 1 h，在93 ℃下處理3 min，再用miRNasy血清反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)保存在4 ℃。

1.2.5在PCR中，10 μL稀釋cDNA，12.5 μL SYBR原料，0.5 μM每個(gè)特異引物和超純水，總體積為25 μL。采用7800實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，其熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃，10 s；57 ℃，30 s；75 ℃，30 s35個(gè)循環(huán)之后，再95 ℃，5 min。

1.2.6用循環(huán)閾值(CT)法定量miRNA的表達(dá)水平，CT定義為熒光信號(hào)跨過(guò)檢測(cè)閾值所需的周期數(shù)。從所研究的miRNA的CT值中減去U6RNA的CT值，計(jì)算參考樣品和靶標(biāo)本的CT值。然后使用得到的標(biāo)準(zhǔn)化ΔCT值WER計(jì)算2-ΔCT的相對(duì)表達(dá)值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS軟件16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間比較采用χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)和方差分析。進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，以檢驗(yàn)變量之間的相關(guān)性。ROC曲線分析，檢測(cè)血清和腹腔液miR-122和miR-199a的最佳臨界值。計(jì)算曲線下面積(AUC)以評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，AUC為0.90～1.00為優(yōu)，0.80～0.90為良，0.70～0.80為一般，0.80～0.60為不合格，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1一般資料的比較 本研究包括80例盆腔子宮內(nèi)膜異位癥(8例合并深浸潤(rùn)性疾病)和70例無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥的婦女。兩組在年齡、體重指數(shù)、盆腔疼痛、痛經(jīng)或月經(jīng)異常方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 研究組的臨床特征[n(%)]

2.2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較 子宮內(nèi)膜異位癥患者血清和腹腔液中IL-6、miR-122和miR-199 a水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 研究組血清和腹腔液IL-6、miR-122和miR-199 a的水平

不同時(shí)期子宮內(nèi)膜異位癥患者血清和腹腔液中miR-122和miR-199 a水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-122和miR-199 a水平與子宮內(nèi)膜異位癥分期無(wú)關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)記物與子宮內(nèi)膜異位癥分期的關(guān)系

血清miR-122和miR-199a檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥的敏感性分別為96.6%和100.0%，特異性分別為94.4%和100%。血清miR-122與IL-6(血清和腹膜液)、miR-199 a(血清和腹膜液)呈正相關(guān)，所有相關(guān)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。血清miR-199 a與IL-6(血清和腹腔液)、miR-122(腹腔液)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表4。

表4 血清miR-122和血清miR-199 a與其他標(biāo)記物的相關(guān)性

ROC曲線(圖1)分析顯示血清miR-122和miR-199a對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥有較高的診斷價(jià)值(表5)。

圖1 miR-122(左)和miR-199a(右)的特異性及敏感性分析

表5 血清miR-122和miR-199 a的ROC曲線分析

3 討 論

目前，子宮內(nèi)膜異位癥主要由腹腔鏡診斷和評(píng)估[9]。因此在疾病的早期階段，由于缺乏癥狀和敏感的生物標(biāo)志物，其檢測(cè)和治療往往被延誤[10]。在本研究中，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清和腹膜中miR-122、miR-199 a和IL-6水平明顯高于對(duì)照組，提示這些分子可作為診斷子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物。國(guó)內(nèi)有研究表明90%的婦女有月經(jīng)逆行，但并非所有的婦女都有子宮內(nèi)膜異位癥[11]。這一事實(shí)表明子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜在分子水平上的表達(dá)可能存在差異。這些分子差異可能會(huì)導(dǎo)致部分婦女患上子宮內(nèi)膜異位癥[12]。如果這些差異確實(shí)是子宮內(nèi)膜異位癥的病理改變，則參與分子可能成為腹腔鏡組織活檢的重要生物標(biāo)志物。

miRNA在多種生理和病理?xiàng)l件下起著至關(guān)重要的作用[13]。血漿miRNA譜改變已檢測(cè)到存在于各種類型的癌癥，包括實(shí)體腫瘤，白血病，B細(xì)胞淋巴瘤，卵巢癌，以及糖尿病和肝硬化[14,15]。由于血清標(biāo)志物檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、便于測(cè)量，檢測(cè)血清特異性循環(huán)miRNA水平的變化有助于子宮內(nèi)膜異位癥的診斷。事實(shí)上許多miRNA被認(rèn)為在子宮內(nèi)膜異位癥中起著一定的作用[16]。且miRNA作為檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物是一個(gè)相對(duì)較新的研究領(lǐng)域，目前研究血清或血漿miRNA預(yù)測(cè)值的研究還很少[17]。

綜上所述，本研究顯示與對(duì)照組相比子宮內(nèi)膜異位癥患者血清、腹膜液中的miR-122和miR-199a水平顯著升高。因此，這些miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥的診斷中具有作為生物標(biāo)志物的潛力。疾病早期非侵入性檢測(cè)這些標(biāo)記物，成本和對(duì)患者的創(chuàng)傷遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于現(xiàn)有的方法。而目前已證實(shí)這些標(biāo)記物在的血清水平與腹膜水平相比具有相關(guān)性，最終可以避免通過(guò)腹腔鏡手術(shù)抽取腹腔液。除本研究外，還可以進(jìn)一步研究血清中其他的miRNA，進(jìn)而找到更為合適的分子標(biāo)記物，明確相關(guān)分子標(biāo)記物診斷子宮內(nèi)膜異位癥的金標(biāo)準(zhǔn)。