瘦素對人腦血管平滑肌細胞活性及ROS表達的影響

李陽陽　王曉雪　張峰菊　許宏俠　劉欣欣

[摘要] 目的 探討瘦素對人腦血管平滑肌細胞（HBVSMCs）活性及活性氧（ROS）表達水平的影響。

方法體外培養HBVSMCs，使用不同濃度瘦素干預HBVSMCs，采用CCK-8法檢測瘦素對細胞增殖活性的影響，蛋白免疫印跡（Western blot）檢測細胞中增殖細胞核抗原（PCNA）和Ki-67的表達水平，流式細胞術檢測瘦素對細胞周期的影響，DCFH-DA探針法檢測細胞內ROS水平。

結果 CCK-8檢測顯示，不同濃度瘦素處理組培養48和72 h后HBVSMCs的增殖活性明顯升高（F=117.818、160.349，P<0.001）;Western blot檢測顯示，不同濃度瘦素處理組培養48 h后HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達水平明顯上調（F=290.000、898.769，P<0.001）;流式細胞術檢測顯示，不同濃度瘦素處理組G0/G1期細胞比例降低（F=264.180，P<0.001），S期和G2/M期細胞比例升高（F=160.033、380.234，P<0.001）;DCFH-DA探針法檢測顯示，不同濃度瘦素處理組HBVSMCs內ROS水平明顯升高（F=394.025，P<0.001）;以上各指標變化均具有濃度依賴性。

結論 瘦素能夠促進HBVSMCs的增殖活性，并誘導細胞中ROS的表達。

[關鍵詞] 瘦素;肌細胞，平滑肌;細胞增殖;活性氧;顱內動脈硬化

[中圖分類號] R977.1;R329.24

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-0270-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.105

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200528.0935.004.html;2020-05-28 12：03

EFFECT OF LEPTIN ON THE ACTIVITY OF HUMAN BRAIN VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS AND THE EXPRESSION OF REACTIVE OXYGEN SPECIES

＼ LI Yangyang， WANG Xiaoxue， ZHANG Fengju， XU Hongxia， LIU Xinxin

＼ （Department of Geriatric Neurology， the First Affiliated Hospital of Henan University， Kaifeng 475000， China）

[ABSTRACT]＼ Objective＼ To investigate the effect of leptin on the activity of human brain vascular smooth muscle cells （HBVSMCs） and the expression of reactive oxygen species （ROS）.

＼ Methods＼ HBVSMCs were cultured in vitro and then treated with different concentrations of leptin. CCK-8 assay was used to observe the effect of leptin on the proliferative activity of cells; Western blot was used to measure the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and Ki-67; flow cytometry was used to observe the effect of leptin on cell cycle; the DCFH-DA probe method was used to measure the level of ROS in cells.

＼ Results

The results of CCK-8 assay showed that HBVSMCs treated with different concentrations of leptin had a significant increase in proliferative activity after 48 and 72 hours of culture （F=117.818，160.349;P<0.001）. The results of Western blot showed that HBVSMCs treated with different concentrations of leptin had significantly upregulated expression of PCNA and Ki-67 after 48 hours of culture （F=290.000，898.769;P<0.001）. The results of flow cytometry showed that HBVSMCs treated with different concentrations of leptin had a significant reduction in the proportion of cells in G0/G1 phase （F=264.180，P<0.001） and a significant increase in the proportion of cells in S phase or G2/M phase （F=160.033，380.234;P<0.001）. The results of the DCFH-DA probe method showed that HBVSMCs treated with different concentrations of leptin had a significant increase in the level of ROS （F=394.025，P<0.001）. All the changes above were concentration-dependent.

＼ Conclusion＼ Leptin can promote the proliferative activity of HBVSMCs and induce the expression of ROS in cells.

[KEY WORDS]＼ leptin; myocytes， smooth muscle;? cell proliferation; reactive oxygen species;? intracranial arteriosclero

心腦血管疾病具有高發病率和高死亡率的特點，是全世界威脅人類健康的重要原因之一[1]。過去20年來，中國心腦血管疾病死亡率急劇上升[2]。心腦血管疾病的主要病因之一是動脈粥樣硬化，大量研究顯示，高脂血癥、高血壓及糖尿病等多種因素與動脈粥樣硬化的發病密切相關[3-4]。瘦素是由肥胖基因編碼的蛋白類激素，能夠調節機體多種生理功能[5]。多項研究表明，瘦素具有多種致動脈粥樣硬化的作用[6-7]。目前研究已證實，活性氧（ROS）能夠加速動脈粥樣硬化的發生發展[8]。然而，瘦素是否能夠通過調控ROS水平在動脈粥樣硬化過程中發揮作用的研究報道甚少。因此，本實驗以人腦血

管平滑肌細胞（HBVSMCs）為研究對象，探究瘦素對HBVSMCs細胞活性及ROS水平的影響，為臨床上治療動脈粥樣硬化及心腦血管疾病提供理論依據。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

HBVSMCs由四川大學華西醫院轉化醫學中心提供;重組人瘦素由美國Preprotech公司提供;DMEM高糖培養基、青霉素-鏈霉素雙抗均購自美國Hyclone公司;胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司;CCK-8檢測試劑購自日本同仁化學研究所;增殖細胞核抗原（PCNA）和Ki-67抗體及辣根過氧化酶標記的二抗盒購自美國Santa Cruz公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;超敏ECL化學發光試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司;細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基科技發展有限公司;ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞培養與處理

HBVSMCs復蘇后，培養在含有體積分數0.10 FBS、100 mg/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中，放置在含體積分數0.05 CO2、37 ℃恒溫培養箱中，每2 d更換1次新的培養液，細胞貼壁生長，待細胞融合達90%時以胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的HBVSMCs以胰酶消化，并接種至6孔板中，當細胞單層融合時除去舊培養液，更換成含不同濃度（0、10、100、1 000 μg/L）瘦素的培養液進行培養，將含0 μg/L瘦素的培養液培養的HBVSMCs作為對照組（A組），分別將含10、100、1 000 μg/L瘦素的培養液培養的HBVSMCs作為瘦素低、中、高濃度組（B、C、D組）。各組HBVSMCs作用48 h后進行相關指標檢測。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 CCK-8法檢測細胞增殖活性 取對數生長期的HBVSMCs，用胰酶消化后接種到96孔板中，分組并處理24、48和72 h，每組的每個時間點設置5個復孔。分別向各孔細胞中加20 μL的CCK-8溶液，將細胞培養板放置在37 ℃培養箱繼續孵育1 h，應用酶標儀分別測定各組細胞450 nm波長處光密度值（OD值）。實驗重復3次，取均值，以OD值表示細胞增殖活性。

1.3.2 Western blot檢測細胞中PCNA和Ki-67蛋白表達水平 收集處理48 h后各組HBVSMCs，加入細胞裂解液在冰上提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。在蛋白中加入適量上樣緩沖液，在沸水浴中加熱變性，取等量蛋白樣品上樣，行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍到達濃縮膠底部斷開電源，將蛋白轉印至PVDF膜上，將膜放置在含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中孵育1 h。TBST洗膜后加入相應一抗，PCNA和Ki-67一抗均為1∶1 000稀釋，4 ℃過夜孵育;TBST洗膜后加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。TBST洗膜后加入超敏ECL化學發光試劑，顯影后在凝膠成像系統中拍照，采用Image J軟件處理圖像，以β-actin為內參照，分別分析各組HBVSMCs中PCNA和Ki-67蛋白的相對表達水平。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期 瘦素處理48 h后，各組HBVSMCs以胰酶消化，離心收集細胞，加入預冷PBS重懸細胞，洗滌細胞2次，向細胞中加入1 mL預冷的體積分數0.70乙醇溶液，4 ℃固定24 h，PBS洗滌細胞后加入500 μL染色緩沖液重懸細胞，再向細胞懸液中加入PI染液25 μL、RNase A 10 μL，37 ℃避光染色30 min。使用流式細胞儀檢測細胞，以Modfit軟件分析各組HBVSMCs周期。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.3.4 DCFH-DA探針法檢測細胞內ROS水平

各組HBVSMCs處理48 h后收集細胞，嚴格按照ROS檢測試劑盒說明書要求測定細胞內ROS水平，即將DCFH-DA熒光染料以無血清培養液稀釋成10 μmol/L工作液濃度，加入到收集的細胞中混勻，放置在細胞培養箱避光孵育1 h，反應結束后以培養液洗滌細胞。使用流式細胞儀測定熒光強度，激發光波長為488 nm，發射光波長為525 nm，以熒光強度表示ROS水平。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.4 統計學分析

采用SPSS 21.0統計學軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料數據均用±s表示，多組間差異比較采用單因素設計的方差分析，兩組間差異比較采用SNK-q檢驗分析。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 瘦素對HBVSMCs增殖活性的影響

CCK-8檢測結果顯示，與對照組比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時均明顯升高（F=117.818、160.349，P<0.001）;與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時均明顯升高（q=8.356～18.800，P<0.05）;與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時均明顯升高（q=10.445、8.235，P<0.05）;在瘦素處理24 h時各組HBVSMCs活性比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

與對照組比，*F=117.818、160.349，P<0.001;與瘦素低濃度組比，&q=8.356～18.800，P<0.05;與瘦素中濃度組比，#q=10.445、8.235，P<0.05。

2.2 瘦素對HBVSMCs中PCNA和Ki-67表達的影響

Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達水平明顯上調（F=290.000、898.769，P<0.001）;與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達水平明顯上調（q=13.064～52.842，P<0.05）;與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達水平均明顯上調（q=17.146、26.901，P<0.05）。見圖1。

2.3 瘦素對HBVSMCs細胞周期進程的影響

流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比較，瘦素低、中、高濃度組G0/G1期細胞百分比明顯降低（F=264.180，P<0.05），S期和G2/M期細胞百分比明顯升高（F=160.033、380.234， P<0.05）;與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組G0/G1期細胞百分比明顯降低（q=10.091、25.696， P<0.05），S期和G2/M期細胞百分比均明顯升高（q=5.838～26.203，P<0.05）;與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組G0/G1期細胞百分比明顯降低（q=15.605，P<0.05），S期和G2/M期細胞百分比明顯升高（q=11.530、16.507，P<0.05）。見圖2。

2.4 瘦素對HBVSMCs內ROS水平的影響

DCFH-DA探針法檢測結果顯示，對照組、瘦素低濃度組、瘦素中濃度組、瘦素高濃度組ROS水平分別為13.25±1.16、17.33±1.46、35.49±3.86和67.88±6.18。與對照組相比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs內ROS水平明顯升高（F=394.025，P<0.001）;與瘦素低濃度組比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs內ROS水平明顯升高（q=14.487、40.326，P<0.05）;與瘦素中濃度組相比較，瘦素高濃度組HBVSMCs內的ROS水平明顯升高（q=25.839，P<0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病是全世界人類最主要的死亡原因，目前已成為全球性公共衛生問題[9]。近年來，隨著人類生活習慣的改變、生活水平的提高以及飲食結構的改變，動脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病的發病率呈逐年上升的趨勢。動脈粥樣硬化的發病機制極其復雜，多項研究結果表明，內皮損傷炎癥反應是造成動脈粥樣硬化的主要原因[10-12]。

血管平滑肌細胞的過度增殖能夠導致血管壁發生病理變化，造成血管內膜損傷，促進動脈粥樣硬化的發生[13]。瘦素是一類廣泛分布在體內的多肽類，由脂肪組織分泌，參與調節多種心腦血管疾病的發生和發展[14]。報道指出，瘦素能夠上調人和小鼠主動脈平滑肌細胞中血小板反應蛋白-1（TSP-1）的表達，促進動脈粥樣硬化的發生[15]。近期已有研究結果顯示，瘦素能夠促進大鼠血管平滑肌細胞增殖并抑制細胞凋亡，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中發揮作用[16]。本實驗采用不同濃度的瘦素干預HBVSMCs，CCK-8檢測顯示，瘦素能夠呈濃度依賴性地促進HBVSMCs的增殖活性，這與以往關于瘦素促進血管平滑肌細胞增殖的結果相符[17-19]。此外，本實驗還通過Western blot檢測HBVSMCs中PCNA和Ki-67表達水平，研究結果顯示，PCNA和Ki-67的表達水平均隨瘦素干預濃度的升高而上調。PCNA和Ki-67作為增殖細胞核抗原，是反映細胞處于增殖狀態的指標[20]。本文結果提示，瘦素通過上調PCNA和Ki-67的表達促進HBVSMCs的增殖活性。流式細胞術檢測結果表明，瘦素能夠降低G0/G1期細胞比例，提高S期和G2/M期細胞比例。這說明經瘦素處理后，HBVSMCs進入S期和G2/M期的細胞增多，細胞增殖加快，提示瘦素能夠加快HBVSMCs周期進程來促進細胞增殖。這與周偉強等[21]的瘦素能促進乳癌MDA-MB-231細胞周期進程的結果相符。

近年來，越來越多的研究結果表明氧化應激在動脈粥樣硬化發生和發展中發揮著關鍵作用[22-24]。ROS是氧化應激啟動的關鍵因子，當體內積累過多的ROS時將導致機體氧化與抗氧化的失衡，最終引起氧化應激反應。研究結果顯示，氧化應激可通過兩方面誘發動脈粥樣硬化的形成：一方面是通過氧化作用對細胞內蛋白質、核酸等物質產生毒害作用，影響大分子物質的生物功能;另一方面是通過激活相應的信號通路引起血管結構和功能的破壞[25]。目前研究結果顯示，瘦素在乳房健康和惡性腺上皮細胞中通過NADPH氧化酶5誘導ROS的產生，激活細胞內氧化應激反應[26]。本實驗通過DCFH-DA探針法檢測瘦素干預對HBVSMCs內ROS水平的影響，結果顯示，瘦素能夠呈濃度依賴性地誘導ROS的表達。這與先前的研究結果相符[27-29]。如YU等[30]研究結果顯示，瘦素能夠誘導大鼠血管平滑肌細胞增殖及細胞內ROS的產生，誘導動脈粥樣硬化的發生，該過程能夠被熊果酸抑制。還有研究結果顯示，瘦素可能通過提高細胞內ROS的產生，參與高血壓動脈粥樣硬化血管重構過程[31]。這些研究提示，瘦素可能通過上調細胞內ROS水平參與動脈粥樣硬化的進展。

綜上所述，瘦素能夠促進HBVSMCs增殖活性并促進細胞內ROS的產生。本實驗為進一步探究瘦素在動脈粥樣硬化中的作用提供實驗基礎。本研究初步探究瘦素對HBVSMCs增殖活性、周期進程及ROS表達的影響，但未對其作用機制進行探究，后續實驗將對其補充。并且瘦素對HBVSMCs凋亡、侵襲和遷移等生物學行為是否存在影響尚不清楚，因此后續實驗也將對此進行探究。

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（本文編輯 于國藝）

[收稿日期]2019-10-24; [修訂日期]2020-04-17

[第一作者]河南省高等學校重點科研計劃項目（18B310013）

[通信作者]李陽陽（1987-），男，碩士。E-mail：lyyglmc@163.com。