miR-141-3p 表達對人異位子宮內膜細胞增殖與凋亡影響及其機制

劉文博　封全靈

[摘要] 目的 探討微小RNA-141-3p（miR-141-3p）對人異位子宮內膜細胞（HEEC）增殖和凋亡的影響及其機制。

方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測異位子宮內膜組織及正常子宮內膜組織中miR-141-3p的表達。體外原代培養(yǎng)HEEC，miR-141-3p mimics轉染至HEEC后，采用MTT法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡率。采用雙熒光素酶報告實驗驗證miR-141-3p與高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的靶向調控作用。

結果 異位子宮內膜組織中miR-141-3p的表達水平明顯低于正常子宮內膜組織（t=56.880，P<0.001）;miR-141-3p過表達能顯著降低HEEC增殖活力（t=10.972，P<0.001），升高細胞凋亡率（t=18.233，P<0.001）;miR-141-3p可靶向結合HMGB1。

結論 miR-141-3p過表達可通過靶向調控HMGB1而抑制HEEC增殖，誘導其凋亡。

[關鍵詞] 子宮內膜異位癥;微RNAs;靶基因修復;高遷移率族蛋白質類;細胞增殖;細胞凋亡

[中圖分類號] R711.71;R394.3

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-0342-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.108

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200610.1435.007.html;2020-06-11 11：19

EFFECT OF MIR-141-3P EXPRESSION ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF HUMAN ECTOPIC ENDOMETRIAL CELLS AND RELATED MECHANISM

LIU Wenbo， FENG Quanling

（Department of Obstetrics and Gynecology， The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of miR-141-3p on the proliferation and apoptosis of human ectopic endometrial cells （HEECs） and related mechanism.

MethodsQuantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-141-3p in ectopic endometrial tissue and normal endometrial tissue. Primary HEECs were cultured in vitro， and after miR-141-3p mimics were transfected into HEECs， MTT assay was used to measure cell viability and flow cytometry was used to mea-

sure apoptosis rate. The dual-luciferase reporter experiment was used to verify the targeted regulatory effect of miR-141-3p and high-mobility group box 1 （HMGB1）.

ResultsThe expression level of miR-141-3p in ectopic endometrial tissue was significantly lower than that in normal endometrial tissue （t=56.880，P<0.001）. Overexpression of miR-141-3p can significantly reduce the proliferative activity of HEECs （t=10.972，P<0.001） and increase cell apoptosis rate （t=18.233，P<0.001）. miR-141-3p could target HMGB1.

ConclusionmiR-141-3p overexpression may inhibit the proliferation of HEECs and induce apoptosis through targeted regulation of HMGB1.

[KEY WORDS]endometriosis; microRNAs; targeted gene repair; high mobility group proteins; cell proliferation; apoptosis

目前關于子宮內膜異位癥發(fā)病機制尚未完全闡明[1-2]。既往研究已表明，體腔化生、血管轉移等均可能引發(fā)子宮內膜異位癥，而人異位子宮內膜細胞（HEEC）惡性增殖及凋亡能力降低是子宮內膜異位癥的主要病理機制[3-4]。因此，深入探究HEEC增殖及凋亡的分子機制有助于提高子宮內膜異位癥治療效果。研究已表明，微小RNA-141（microRNA-141，miR-141）在子宮內膜異位癥病人中表達下調，但關于其具體作用機制尚未明確[5-6]。miR-141是微小RNA-141-3p（microRNA-141-3p，miR-141-3p）的前體，關于miR-141-3p對HEEC生物行為的影響及其機制研究相對較少。已有研究表明，子宮內膜異位癥病人中高遷移率族蛋白 B1（HMGB1）的表達水平升高，其可能通過調節(jié)新生血管生成而參與子宮內膜異位癥發(fā)生過程[7]。Target Scan網站預測顯示，HMGB1可能是miR-141-3p的靶基因，但miR-141-3p是否可通過靶向調控HMGB1而影響HEEC的增殖及凋亡尚未明確。為此，本研究探討miR-141-3p表達對HEEC增殖及凋亡的影響，分析其與HMGB1的靶向調控關系及其可能作用機制。現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年2月—2018年10月，選取本院收治的45例子宮內膜異位癥病人為研究對象，年齡35～60歲，平均（45.52±5.62）歲。臨床分期[8]：Ⅱ期10例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例。所有病人均經手術病理證實為子宮內膜異位癥，術前3個月內未服用性激素類藥物，于術中切取異位內膜組織。同時，選取同期因婦科良性病變進行子宮切除術的43例病人為對照組，年齡為42～60歲，平均（56.72±7.13）歲。所有病人均經手術病理證實，術中切取正常子宮內膜組織。排除合并其他生殖系統(tǒng)腫瘤者。兩組病人年齡、月經周期等相比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，病人均知情并簽署同意書。

1.2 實驗材料

DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司;Ⅰ型膠原酶購自上海百賽生物技術股份有限公司;miR-141-3p mimics、miR-141-3p抑制劑（anti-miR-141-3p）及其各自陰性對照試劑均購自廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑購自北京全式金生物技術有限公司;反轉錄試劑盒與實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司;MTT細胞增殖檢測試劑盒購自上海生物工程股份有限公司;Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司;雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;RIPA裂解液購自美國Sigma公司;兔抗人Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax抗體購自美國Abcam公司;HRP標記的IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗人HMGB1抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 體外原代培養(yǎng)HEEC 應用差速梯度離心與細胞貼壁時間差等方法分離異位內膜腺上皮細胞及間質細胞。剪碎膜組織，Ⅰ型膠原酶（2 g/L）消化60 min，用100目濾網過濾，將含有PBS的DMEM培養(yǎng)液加入濾液內，4 ℃條件下，以700 r/min離心7 min，棄上清，接種至培養(yǎng)皿（間質細胞），加入含有體積分數(shù)0.10胎牛血清的培養(yǎng)液，放入37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)[9]。

1.3.2 實驗分組 待HEEC傳代至第3代時，收集生長狀態(tài)良好的HEEC，隨機分為miR-NC組（細胞中轉染miR-NC）、miR-141-3p組（轉染miR-141-3p mimics的細胞）。嚴格按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書的步驟進行操作，轉染6 h后更換含有體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對數(shù)生長期的細胞完成功能驗證實驗。

1.3.3 qRT-PCR檢測miR-141-3p表達水平 采用Trizol法分別提取正常子宮內膜組織、異位子宮內膜組織、HEEC的總RNA，依次分別加入200 μL 氯仿與500 μL異丙醇，4 ℃下、12 000 r/min離心15 min，棄上清，RNA沉于管底。以體積分數(shù)0.75乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后加入適量無RNA酶水，充分溶解RNA，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。應用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，qRT-PCR法檢測miR-141-3p相對表達量。反應條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共循環(huán)40次。miR-141-3p以U6為內參，采用 2-ΔΔCt法計算miR-141-3p的表達水平。

1.3.4 MTT檢測細胞增殖 收集轉染后各組的HEEC，胰蛋白酶消化，制備細胞懸浮液，以每孔3×105個細胞的密度接種于96孔板。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時每孔入MTT溶液20 μL，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液150 μL，低速振蕩10 min。利用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度（A）。每組實驗均重復3次。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組對數(shù)生長期HEEC，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，4 ℃下、10 000 r/min離心5 min。PBS洗滌細胞，分別加入200 μL結合緩沖液，依次加入5 μL 的Annexin V-FITC與5 μL 的PI，室溫避孵育20 min。置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 每組實驗均重復3次。

1.3.6 熒光素酶報告基因檢測 靶基因預測網站預測miR-141-3p的靶基因，預測顯示miR-141-3p與HMGB1的3′UTR存在結合位點，將含有miR-141-3p結合位點及其突變位點的HMGB1-3′UTR片段插入PGL3熒光素酶報告基因載體，構建野生型（WT-HMGB1）與突變型（MUT-HMGB1）的熒光素酶報告載體。實驗分為4組：WT-HMGB1+miR-NC共轉染組、WT-HMGB1+miR-141-3p mimics共轉染組、MUT-HMGB1+miR-NC共轉

染組、MUT-HMGB1+miR-141-3p mimics共轉染組。轉染24 h后收集細胞，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組相對熒光素酶活性。每組實驗均重復3次。

1.3.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測HMGB1、Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax蛋白表達 分別取各組HEEC，加入細胞裂解液裂解細胞，4 ℃條件下、12 000 r/min離心15 min。收集上清，BCA法測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，取30 μg蛋白上樣進行100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（稀釋比1∶1 000），4 ℃孵育24 h，TBST清洗;加入二抗（稀釋比1∶2 000），室溫孵育30 min，TBST洗膜。應用ECL試劑盒進行化學發(fā)光反應，置于凝膠成像系統(tǒng)并應用Quantity One軟件定量分析蛋白條帶灰度值。每組實驗均重復3次。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常和異位子宮內膜組織miR-141-3p表達

本文qRT-PCR檢測結果表明，正常與異位子宮內膜組織中miR-141-3p表達水平分別為0.87±0.08和0.17±0.02，異位子宮內膜組織中miR-141-3p表達水平較正常子宮內膜顯著降低，差異有顯著意義（t=56.880，P<0.001）。

2.2 miR-141-3p過表達對HEEC增殖與凋亡及相關蛋白影響

HEEC中轉染miR-141-3p mimics后，與miR-NC組（對照組）相比，miR-141-3p組（實驗組）細胞活力顯著降低（t=10.972～13.403，P<0.001），細胞凋亡率顯著升高（t=18.233，P<0.001），Cyclin D與Bcl-2蛋白的水平降低（t=24.931、25.456，P<0.001），P21與Bax蛋白的水平則升高，差異均有統(tǒng)計學意義（t=19.312、20.175，P<0.001）。見圖1與表1、2。

2.3 miR-141-3p靶向對HMGB1蛋白表達的影響

Target Scan預測顯示，HMGB1的3′UTR含有miR-141-3p的互補序列。見圖2A。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，WT-HMGB1+miR-NC共轉染組、WT-HMGB1+miR-141-3p mimics共轉染組、MUT-HMGB1+miR-NC共轉染組和MUTHMGB1+miR-141-3p mimics共轉染組HMGB1的相對熒光素酶活性分別為1.05±0.10、0.27±0.03、1.07±0.10和1.02±0.09，HEEC細胞中轉染miR-141-3p mimics可顯著降低含有miR-141-3p結合位點熒光報告載體的相對熒光素酶活性（n=9，t=22.413，P<0.001）;后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.115，P>0.05）。Western blot的檢測結果顯示，miR-NC組、miR-141-3p組、anti-miR-NC組和anti-miR-141-3p組HMGB1蛋白表達分別為0.63±0.06、0.21±0.02、0.64±0.06和0.99±0.10，各組比較差異有顯著性（n=9，F(xiàn)=208.278，P<0.001）。miR-141-3p過表達后，細胞中HMGB1蛋白的水平為0.21±0.02，與miR-NC組的0.63±0.06相比較顯著降低（t=19.922，P<0.05）;抑制miR-141-3p表達后，細胞中HMGB1蛋白水平為0.99±0.10，與anti-miR-NC組的0.64±0.06相比較顯著升高（t=9.004，P<0.05）。見圖2B。表明HMGB1是miR-141-3p的靶基因，miR-141-3p可負性調控HMGB1的表達。

3 討論

子宮內膜異位癥主要指子宮腔被覆內膜外存在子宮內膜組織生長及浸潤。研究表明，miRNA可通過調控下游靶基因表達而參與子宮內膜異位癥發(fā)生過程[10-12]。但仍有部分miRNA在子宮內膜異位癥中的機制尚未完全闡明，因此本研究探尋新型miR-141-3p在子宮內膜異位癥發(fā)生過程中的可能作用機制。miR-141-3p在腫瘤細胞中呈低表達，miR-141-3p過表達后可顯著抑制細胞增殖及其侵襲能力，誘導細胞凋亡[13-20]。但是，miR-141-3p在子宮內膜異位癥中的表達及其作用機制尚不明確。本研究結果顯示，miR-141-3p在異位子宮內膜組織中呈低表達，說明miR-141-3p表達降低可能參與子宮內膜異位癥發(fā)生過程。本文進一步研究顯示，miR-141-3p過表達后，HEEC的增殖能力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達下調，P21、Bax蛋白表達上調。已有報道指出，Cyclin D1可正向調控細胞周期進程，促進細胞增殖;P21可以通過抑制Cyclin D1與CDK4結合而阻滯細胞周期進程，抑制細胞增殖[21-26]。Bcl-2、Bax蛋白是HEEC凋亡過程中的重要作用因子，Bcl-2蛋白表達升高可抑制HEEC凋亡，而Bax蛋白表達升高可促進HEEC凋亡[27]。說明miR-141-3p過表達可通過干擾細胞增殖及凋亡相關蛋白而調節(jié)HEEC的增殖及凋亡行為。即miR-141-3p過表達可抑制HEEC的增殖，促進其凋亡。

HMGB1在子宮內膜異位癥病人血清中的表達水平升高，并可作為子宮內膜異位癥診斷的重要指標[28]。HMGB1屬于DNA結合蛋白。研究表明，HMGB1可促進炎癥反應及血管生成，還可通過調節(jié)多種信號轉導通路而參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程[29。相關研究報道指出，HMGB1還可通過促進Treg細胞分泌及增強其介導的免疫抑制作用而參與子宮內膜異位癥發(fā)生過程[30]。本研究結果表明，miR-141-3p可靶向調控HMGB1表達。提示miR-141-3p過表達可能通過靶向調控HMGB1而抑制HEEC增殖，誘導其凋亡。

綜上所述，子宮內膜異位癥病人中miR-141-3p的表達明顯降低，miR-141-3p過表達可能通過調控HMGB1的表達而抑制HEEC的增殖及促進其凋亡。本研究結果為揭示子宮內膜異位癥的發(fā)病機制奠定理論基礎，為子宮內膜異位癥治療提供了新的思路。但關于miR-141-3p在子宮內膜異位癥發(fā)生及發(fā)展過程中，具體通過調控哪種信號通路而發(fā)揮作用尚需進一步探究。

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（本文編輯 于國藝）

[收稿日期]2019-10-27; [修訂日期]2020-05-13

[基金項目]河南省醫(yī)學科技攻關計劃項目（20180214253）

[第一作者]劉文博（1983-），女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：liuwenbo201907@163.com。