不同發酵菌種對大果山楂酵素品質的影響

張巧 ，柯博芳，唐小閑 ，段振華 *

1. 賀州學院食品與生物工程學院（賀州 542899）；2. 賀州學院食品科學與工程技術研究院（賀州 542899）；3. 廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地（賀州 542899）

大果山楂又名麻缺頓、廣西楂（商品名）等，為薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物，其果形大，果面光滑明艷，性微溫，味甘、酸、澀[1-2]。大果山楂含有多種酚類活性成分，具有降低血清膽固醇和甘油脂，降壓利尿和鎮靜等藥用價值，是難得的藥食兩用食品[3]。目前，以大果山楂作為生產原料的產品有山楂干片、山楂糕、山楂醋等，而山楂酵素這種生物發酵制品卻很少見，與之相關的文獻也不多。

酵素是一種微生物發酵產品，擁有許多生物活性成分，對于人體生命現象的運動有一定的作用。酵素擁有其他飲料所沒有的獨特風味、香味和滋味，且富含豐富的酶類（超氧化物歧化酶、蛋白酶、纖維素酶等）、酚類、有機酸類等對人體有益的生物活性物質，還具有抗菌、抗炎、凈化、分解消化、潤腸通便等作用[4]。現今，隨著人們認識到酵素食品的重要性，我國在逐步加快酵素產品的研究。新型的酵素食品將原料擴展為蔬菜、水果、菇類等，酵母菌、乳酸菌和霉菌是其發酵的主要微生物。這些有益菌通過促進一些生化反應的進行，有助于實現糖類、脂質、蛋白質之間相互轉化[5]。此外，有益菌還可以對原有的一些不良風味進行改進，產生一些新的功能成分，且酵素食品的功能保健作用增強。王瑾等[6]研究的桑葚酵素就是利用乳酸茵、酵母菌和其他益生菌在特定條件下發酵桑葚原汁得到的一種營養豐富、口感俱佳且美容養顏的功能性發酵飲品。另外，賈麗麗等[7]以酵母菌和乳酸菌發酵冬棗泥得到的冬棗酵素，香氣濃郁，酸甜可口，品質得到較大的提升。莫大美等[8]研究，由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌發酵的玫瑰酵素比酵母菌和乳酸菌發酵的更優。由此可見，不同發酵菌種對酵素品質有著較為重要的影響。

研究通過自然發酵、單菌種（酵母菌）發酵、雙菌種（酵母菌+醋酸菌）發酵以及三菌種（酵母菌+醋酸菌+乳酸菌）發酵來探索這些發酵菌種對大果山楂酵素品質的影響，為大果山楂酵素工藝的研發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂，賀州泰和水果店購買；福林酚試劑（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2, 2-聯苯基-1-苦基阱基（2, 2-Diphenyl-1-picryldrazyl，DPPH）即（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；酚酞（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；無水乙醇、無水碳酸鈉、重鉻酸鉀、三羥甲基氨基甲烷等（分析純）：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器，重慶雅瑪拓科技有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；高速冷凍離心機，Eppendorf公司；722N型可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的培養

酵母菌：馬鈴薯葡萄糖培養基，接種后在30 ℃、180 r/min條件下培養36～48 h。

乳酸菌：MRS培養基，接種后30 ℃培養24～48 h。

醋酸菌：醋酸菌培養基，接種后在30 ℃、180 r/min條件下培養24～48 h。

1.3.2 大果山楂酵素的制備

大果山楂→清洗干凈→切塊、去核、去梗→鹽水護色→清水漂洗→接種→裝瓶→加糖→消毒封口→發酵→酵素

操作要點：把大果山楂切成4塊，去核去梗，放入0.1%鹽水中護色，然后撈出沖洗，瀝干。將大果山楂果肉和白砂糖紫外處理45 min，分別接種果肉質量3%的酵母菌、1.5%酵母菌+1.5%醋酸菌、1%酵母菌+1%醋酸菌+1%乳酸菌、等量無菌水，裝入滅菌后的發酵瓶中，再在中、上層鋪入白糖，大果山楂與白糖質量比3∶1，消毒封口，發酵，發酵過程中，每6 d取樣。將所取大果山楂酵素樣品離心（12 000 r/min，10 min，10 ℃），測定上清液的總酸度、酒精度、總酚含量、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、SOD酶活力及感官評分。

1.3.3 總酸的測定

參照GB 5009.239—2016測定酵素中的酸度。

1.3.4 總酚含量的測定

總酚含量的測定采用Folin-酚試劑法，具體參考文獻[9]，并稍作修改。取0～0.02 mg/mL的沒食子酸進行總酚標準曲線的測定，得線性回歸方程為：y=1.579 3x+0.013 4（x是沒食子酸濃度，y是吸光度），R2=0.998。根據總酚標準曲線方程和樣液中的吸光度測定酵素中的總酚濃度。

1.3.5 SOD活力的測定

根據鄰苯三酚自氧化法[10]測定SOD，詳細做法參照表1，在波長325 nm處每隔15 s測定1次吸光度A0，抑制率和SOD活力分別按照公式（1）和（2）進行計算。

表1 鄰苯三酚自氧化速率測定加樣表

式中：V1為反應液的總體積，mL；V2為所測樣品體積，mL；ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率；ΔASOD為樣品光密度值變化速率；n為稀釋倍數。

1.3.6 酒精度的測定

采用重鉻酸鉀比色法[11]對酵素中的酒精度進行測定。取體積分數0～0.1%的乙醇進行酒精度標準曲線的測定，得線性回歸方程為：y=1.517 7x+0.006 2（x是乙醇體積分數，y是吸光度），R2=0.993。根據酒精度標準曲線方程和樣液中的吸光度測定酵素中的酒精度。

1.3.7 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定具體參照文獻[12]。

1.3.8 感官評審標準

參照表2對酵素產品進行感官評定，具體的感官評定人員均為食品專業人士，并嚴格按照評分標準進行評分，然后給出相應的分數。

表2 感官評定標準[13]

1.3.9 數據處理

所有數據均為3次以上重復試驗的平均值±標準誤差，使用Origin 8.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同發酵菌種對大果山楂酵素中總酸的影響

酸度是衡量大果山楂酵素發酵成熟度的主要指標，同時也是反應大果山楂發酵液品質的重要理化指標[14]。由圖1可知，自然發酵、單菌種、雙菌種和三菌種發酵的總酸度隨著時間的延長呈現出先上升后緩慢下降的趨勢。自然發酵在微生物的慢速生長和代謝下產有機酸，而單菌種兼性厭氧酵母菌在前期有氧情況下大量繁殖，抑制其他微生物代謝，產生乙醇和二氧化碳，只有部分二氧化碳溶于水，因此，自然發酵的總酸度要高于單菌種發酵。發酵3～12 d內，總酸度上升趨勢較快，且三菌種發酵酸度要高于其他發酵，原因可能是乳酸菌和醋酸菌通過利用酵素液中的營養物質，產生大量的有機酸和醋酸；發酵24～30 d內，總酸度下降的幅度都不大，基本趨于平穩。

圖1 不同發酵菌種對大果山楂酵素中總酸的影響

2.2 不同發酵菌種對大果山楂酵素中總酚的影響

大果山楂發酵過程中酚類物質是其重要的功能性成分，對其口感有著決定性作用，同時對酵素的色澤、香氣以及抗氧化性有一定的影響[15]。由圖2可知，自然發酵、單菌種、雙菌種、三菌種發酵的總酚濃度先不斷升高后趨于平緩，由初始1 mg/mL左右上升到6～8 mg/mL，這主要是因為在發酵過程中，大果山楂中的酚類物質隨著發酵時間的延長，逐漸溶入到山楂酵素液中[16]。發酵3～12 d，總酚濃度升高趨勢較大；發酵至24 d，總酚含量開始略微下降，有可能是酚類物質氧化的原因；這2個過程都能看出這4種發酵總酚濃度的高低，三菌種發酵＞雙菌種發酵＞單菌種發酵＞自然發酵。

2.3 不同發酵菌種對大果山楂酵素中SOD活性的影響

生物體在新陳代謝的過程中往往會產生有害物質，SOD能起到消除的作用。有研究發現，它能抑制心腦血管疾病，也有抗衰老、抗疲勞、抗輻射等效果[17]。大果山楂發酵過程中產生的SOD酶活性物質可以提高免疫力，是細胞防御系統中主要的抗氧化酶[18]。如圖3所示，發酵過程中，三菌種發酵、雙菌種發酵、單菌種發酵以及自然發酵的酵素SOD酶活力在24 d時達到最高，依次為21.59，19.85，18.72和16.27 U/mL；24～30 d的SOD酶活力均趨于平緩。可以看出，三菌種發酵的酵素SOD酶活力最高，雙菌種發酵次之，其次是單菌種發酵，最后是自然發酵。

圖2 不同發酵菌種對大果山楂酵素中總酚的影響

圖3 不同發酵菌種對大果山楂酵素中SOD活性的影響

2.4 不同發酵菌種對大果山楂酵素中酒精度的影響

由圖4可知，隨著時間變化，自然發酵、單菌種發酵、雙菌種發酵和三菌種發酵的酒精度呈現先升后降的變化趨勢。發酵18 d，單菌種發酵的酒精度最高點達到25.7%vol，自然發酵、雙菌種發酵、三菌種發酵的酒精度最高點依次為16.7%，13.7%和12.6%vol，單菌種發酵的酒精度遠遠高于其他發酵，這是因為酵母菌在產生大量酒精的同時，還抑制了其他微生物的生長，使得酵素酒味偏重。相對來說，三菌種發酵的酒精度隨時間變化都比其他發酵的要小，原因可能是醋酸菌和乳酸菌的生長繁殖，使得酵母菌可利用的營養物質減少，酒精的形成量降低。

2.5 不同發酵菌種對大果山楂酵素中DPPH自由基清除率的影響

由圖5可知，隨著時間的延長，通過接種4種發酵菌種的大果山楂酵素，其DPPH自由基清除率的變化趨勢為先上升后下降。DPPH自由基清除能力與總酚的濃度有一定的關聯，一開始隨著總酚濃度的升高而呈現上升的趨勢，后面出現緩慢下降可能是抗氧化活性強的物質被微生物降解或者通過結構修飾成抗氧化活性弱的物質所造成的[19]。發酵18 d，三菌種發酵的酵素DPPH自由基清除率達到最大值88.9%，比其他發酵高。發酵24 d，單菌種發酵的酵素DPPH自由基清除率達到最大值85.7%，但比雙菌種和三菌種發酵低。因而總體來說，三菌種發酵的酵素DPPH自由基清除能力最強，雙菌種發酵次之，其次是單菌種發酵，最后是自然發酵。

圖4 不同發酵菌種對大果山楂酵素中酒精度的影響

圖5 不同發酵菌種對大果山楂酵素中DPPH自由基清除率的影響

2.6 不同菌種發酵大果山楂過程中感官評分的變化

由圖6可知，隨著時間的變化，自然發酵、雙菌種發酵和三菌種發酵的感官評分呈現出上升的趨勢，最后趨于平穩，最高評分都能達到80分以上，三菌種評分最高，88.2分。而單菌種發酵的感官評分變化為先下降后上升，最后稍微上下波動，其評分最差，低于60分。總體看來，感官評分高低順序為：三菌種發酵＞自然發酵＞雙菌種發酵＞單菌種發酵。

圖6 不同菌種發酵大果山楂過程中感官評分的變化

3 結論

在大果山楂發酵過程中，自然發酵、單菌種、雙菌種和三菌種發酵的總酸度隨著時間的延長呈現出先上升后緩慢下降的趨勢，其中三菌種發酵的酵素總酸度相對偏高，適當的酸能柔和酒精所帶來的苦澀味，提高酵素的營養物質，賦予其獨特的風味；發酵18 d時，單菌種發酵的酵素酒精度最高，達到25.7%vol，自然發酵次之，其次是雙菌種發酵，最后是三菌種發酵，酒精度稍低，酵素的口感不會那么苦澀；由于總酚對抗氧化性有一定的影響，因此，發酵過程中，總酚濃度升高，DPPH自由基清除率和SOD酶活力也隨之上升，且三菌種發酵＞雙菌種發酵＞單菌種發酵＞自然發酵；結合感官評分，酵母菌、醋酸菌和乳酸菌三菌種發酵的酵素品質更佳。