金英消食口服液的HPLC指紋圖譜與含量測定研究

任瑩 王虎 韓雙

【摘 要】 目的：建立金英消食口服液的HPLC指紋圖譜及該制劑中橙皮苷含量測定的方法，為其質量控制提供依據。方法：采用HPLC法，用依利特Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶ 80，V/V）為流動相;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為283 nm。測定16批金英消食口服液的指紋圖譜，并用國家藥典委員“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件2012版”對其進行相似度評價;同時建立該制劑中橙皮苷的定量測定方法。結果：16批金英消食口服液的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9;橙皮苷含量測定方法專屬性好，精密度、穩定性、重現性等均符合方法學要求，且在一定范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系。結論：所建立的指紋圖譜和含量測定方法專屬性好、穩定可靠，可用于金英消食口服液的質量控制。

【關鍵詞】 高效液相色譜法;指紋圖譜;橙皮苷;質量控制

【中圖分類號】R284.1 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）10-0051-06

Abstract：Objective To establish the HPLC fingerprint of Jinying Xiaoshi oral solution and determine the content of hesperidin， so as to provide a scientific basis for the quality control of Jinying Xiaoshi oral solution. Methods An HPLC method was used and the analysis was performed on an Hypersil ODS2 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile-0.1% phosphoric acid （20∶ 80，V/V） as mobile phase. The mobile phase flow rate was 1.0 mL·min-1.The temperature was 30 ℃.The detection wavelength was 283nm. The fingerprint of 16 batches of samples was tested and similarity evaluation was performed using Chinese Medicine Chromatographic Fingerprints Similarity Evaluation System software （2012）.Besides， the content of hesperidin was determined. Results Totally 13 common peaks were identified in the fingerprint of Jinying Xiaoshi oral solution. The similarities between the 16 batches of samples and the reference fingerprint were all greater than 0.9.The method of quantitative analysis was established. The precision， stability and repeatability complied with the requirements of methodology. The standard curve of hesperidin had good linear relationship in ranges of the tested concentrations. Conclusion The HPLC fingerprint with high characteristics and the established content determination are stable， reliable and reproducible， which could be used for quality control of Jinying Xiaoshi oral solution.

Keywords：HPLC; Fingerprint; Hesperidin; Quality Control

金英消食口服液是太和縣中醫院臨床應用多年的特色院內制劑，主要由雞內金、麩炒白術、焦神曲、焦山楂、焦麥芽、姜半夏、蒲公英、陳皮、茯苓九藥味組成。功能健胃醒脾、消食化滯，主要用于脾虛食滯所致的腹脹、納呆、厭食、腹瀉、小兒疳積。金英消食口服液作為質優價廉且臨床應用多年的醫院傳統中藥制劑，亟需建立完善的質量控制及評價方法，以保障制劑質量，為其進一步在臨床推廣應用奠定基礎。實驗通過高效液相色譜法建立金英消食口服液的指紋圖譜和橙皮苷的含量測定方法，并制定橙皮苷的含量限度。

1 儀器與材料

UltiMate3000高效液相色譜儀（DAD檢測器，賽默飛世爾科技有限公司）; XP205DR型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;KQ-500DE超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司），萬能粉碎機（上海賀帆儀器有限公司）。

對照品橙皮苷（批號：110721-201617，含量以96.1%計）購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇，均為色譜純，美國天地公司;磷酸，分析純，天津北方天醫化學試劑廠;哇哈哈純凈水

金英消食口服液為太和縣中醫院中藥制劑室生產，批號分別為20160511、20160513、20160515、20180510、20180606、20180720、20180731、20180808、20180818、20180821、20181005、20181007、20190104、20190117、20190306、20190430、20190726、20190810、20190906。缺味陰性樣品均由中藥制劑室自制。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取橙皮苷對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇-0.1%磷酸溶液（1∶ 1），制成濃度為每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取金英消食口服液樣品，精密量取1 mL，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，取上清液5 mL置于20 mL的容量瓶中以甲醇-0.1%磷酸（1∶ 1）溶液定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 金英消食口服液缺陳皮溶液的制備 按金英消食口服液的制備工藝制得缺陳皮的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺陳皮陰性供試液。

2.2 色譜條件 UltiMate3000高效液相色譜儀，依利特Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶ 80，V/V）為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長283 nm。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 按“2.2”色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、缺味陰性對照溶液，依次注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果顯示，各陰性對照均無干擾（如圖1所示），說明該方法專屬性較好。

2.3.2 線性關系考察 將制備的濃度為11.12 μg/mL的對照品溶液，分別精密進樣1、2、5、10、15、20 μL，記錄色譜圖及峰面積。以橙皮苷的量（μg）為縱坐標（Y），峰面積為橫坐標（X），進行回歸分析，得回歸方程：Y=0.03021 X-5.114×10-4;r=0.9999。結果表明，橙皮苷在為0.01112～0.2224μg的范圍內與峰面積呈良好線性關系。見表1、圖2。

2.3.3 精密度試驗 取濃度為11.12 μg/mL的對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，橙皮苷的平均峰面積是1.857，RSD為0.1%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取金英消食口服液（批號：20160511）6份，按照“2.1.2”項下方法制備供試液，分別進樣測定。結果6次的峰面積平均值為1.731，RSD為0.3%，表明該方法的重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取供試品（批號：20160511）溶液，在配制后0、2、5、8、10、12、24h分別進樣測定，結果橙皮苷峰面積平均值為1.714，RSD為0.6%（n=6），表明供試液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密移取已知含量為0.4144 mg/mL的金英消食口服液（批號：20160511）6份，每份0.5 mL，分別精密加入濃度為0.0556 mg/mL的橙皮苷標準品儲備液4 mL。按“2.1.2”項下方法制備供試液，分別進樣測定，記錄峰面積，計算回收率，平均回收率為99.9%（RSD=0.8%，n=6），可見此方法測定橙皮苷回收率較高，準確度較高。結果見表2。

2.4 含量限度考察 通過投料前對陳皮藥材中橙皮苷含量測定，及生產的成品中橙皮苷的含量比較，計算得到該工藝橙皮苷的轉移率。結果見表3。

結果表明，批號為20160511、20160513、20160515三批金英消食口服液中橙皮苷的含量為0.410～0.411 mg/mL，生產原料陳皮（批號：16030102）中橙皮苷的含量為2.95%～2.98%，制成制劑后相當于每mL含橙皮苷為1.97～1.99mg，最低轉移率為20.7%。批號為20161228、20161229、20161230三批金英消食口服液中橙皮苷的含量為0.650～0.686 mg/mL，生產原料陳皮（批號：16090205）中橙皮苷的含量為3.80%～3.81%，制成制劑后相當于每mL含橙皮苷為2.53～2.54 mg，最低轉移率為25.6%。根據中國藥典2015年版一部規定：陳皮飲片中橙皮苷的含量不得少于2.5%，按最低轉移率為20.7%計算，制成制劑后相當于每mL不得少于0.35 mg，故擬定該制劑每mL含橙皮苷不低于0.35 mg。

2.5 指紋圖譜的建立[1-4] 取16批金英消食口服液樣品，分別按照“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液，分別進樣測定，記錄色譜數據，將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012）”，以S1為參照，采用平均數法，時間寬度為0.6，多點校正，自動匹配，生成對照圖譜，確定13個共有峰，并計算相似度。16批金英消食口服液疊加圖譜及對照圖譜見圖3。相似度結果均大于0.9，結果見表4。可見不同批次的金英消食口服液樣品之間具有較好的相似性，建立的對照圖譜特征性較強。

3 討論

醫療機構制劑尤其是中藥制劑品種是我國新藥的來源，如三九胃泰、復方丹參滴丸、大青葉注射液、地龍注射液等都是醫療機構制劑轉化成新藥的產物。新藥的研制在醫療機構制劑基礎上，經過長期臨床療效驗證，可以有效縮短研發投入和時間，提高研發注冊成功率。將特色優秀的醫療制劑轉化為新藥，可提高我國新藥研發質量和水平，促進醫藥領域健康發展。

金英消食口服液處方系太和縣中醫院名老中醫遵照中醫理論，結合多年臨床經驗，治療功能性消化不良證屬脾虛食滯所擬定的方劑，臨床應用多年，療效顯著（尤其是用于小兒疳積）。金英消食口服液中雞內金[5-6]、焦神曲[7-8]、焦麥[9-10]芽現代研究中尚未有特異的指標性成分;焦山楂[11-12]、姜半夏[13-14]、麩炒白術[15]、蒲公英[16]、茯苓[17]雖然在中國藥典及文獻中有以氨基酸、有機酸等為對照品的薄層鑒別，但這些成分在動植物中廣泛存在，在復方制劑的質控方面專屬性不佳，實際運用較少。故利用常規的薄層鑒別方法對該制劑進行定性研究存在較大困難。定量分析方面，上述藥味在藥典中均無含量控制的指標性成分，只有陳皮規定了含量測定的指標即橙皮苷。

有效控制中藥的質量，是保證中醫臨床療效的前提。2016年國務院印發《中醫藥發展戰略規劃綱要（2016-2030）》，提出“推進實施中藥標準化行動計劃，構建中藥產業全鏈條的優質產品標準體系”。指紋圖譜技術是目前國際上公認的天然藥物質量控制的有效方式之一，突破了長期以來以單一指標或幾個化學成分評價藥品質量的限制，可以全面反映中藥所含的化學成分的種類和數量。本實驗研究建立金英消食口服液的指紋圖譜，并測定橙皮苷的含量，方法特征性強、專屬性好、穩定可靠，可用于金英消食口服液的質量控制并納入質量標準，為金英消食口服液的質量控制提供更全面可靠的依據，進而保證制劑質量，確保臨床療效。實驗建立了金英消食口服液的指紋圖譜，并確定了13個共有峰，為該制劑進一步的物質基礎研究提供參考。參考文獻

[1]邵靜媛.質量源于設計理念在若干中藥分析方法中的應用研究[D].杭州：浙江大學，2019.

[2]蔣愛，陳健，韓加偉，等.小兒退熱洗劑HPLC指紋圖譜及指標成分測定[J].中草藥，2019，50（13）：3077-3083.

[3]張寧. 基于中藥質量標志物的杏貝止咳顆粒質量標準提升研究[D].南京：南京中醫藥大學，2019.

[4]左雯雯，吳鑫，黃勝良，等.新生化顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2018，43（18）：3676-3682.

[5]王鵬飛，高慧敏，鄒忠梅，等.藥食兩用中藥雞內金的研究概況[J].中國藥學雜志，2017，52（7）：535-538.

[6]MIN T Q， LIU M，ZHANG H J，et al. Molecular and pharmacological characterization of poultry （Gallus gallus， Anas platyrhynchos， Anser cygnoides domesticus） and pig （Sus scrofa domestica） melanocortin-5 receptors and their mutants [J]. General and comparative endocrinology， 2019：283.

[7]張慧茹，張婷婷，許枬，等.基于NMR指導的六神曲成分研究[J].中草藥，2019，50（16）：3764-3768.

[8]馬維維，戚岑聰，張艷聰，等.六神曲固態協同發酵工藝優化及物質動態變化研究[J].中華中醫藥學刊，2017，35（5）：1291-1294.

[9]李琦. 小兒飲舒顆粒的制備工藝及質量標準研究[D].北京：北京中醫藥大學，2018.

[10]孫華，梁杰，張夢琪，等.麥芽炮制歷史沿革及現代研究[J].廣東藥科大學學報，2018，34（2）：254-257.

[11]姜濤，施枝江，陳林明，等.山楂及其不同炮制品的質量評價研究[J].中醫藥導報，2018，24（21）：78-80，83.

[12]陳寶龍，鄭朝華，陳玉英.山楂藥材黃酮類成分毛細管電泳指紋圖譜研究[J].中國藥業，2019，28（2）：4-6.

[13]容艷芬，劉先瓊，劉艷菊.多指標綜合加權評分研究姜半夏炮制工藝[J].湖北中醫藥大學學報，2017，19（2）：31-35.

[14]左軍，牟景光，胡曉陽.半夏化學成分及現代藥理作用研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2019，21（9）：26-29.

[15]李瀅，楊秀偉.麩炒白術化學成分的研究[J].中國現代中藥，2018，20（9）：1074-1079.

[16]劉愛朋，郭利霄，薛紫鯨，等.基于指紋圖譜和多組分含量測定的蒲公英藥材質量控制研究[J].中國中藥雜志，2018，43（18）：3715-3721.

[17]田玉橋，尹火青，陳三春，等.茯苓不同初加工方法比較研究[J/OL].中藥材，2019（5）：1038-1040[2019-10-28].https：//doi.org/10.13863/j.issn1001-4454.2019.05.016.

（收稿日期：2020-02-18 編輯：劉斌）