乳脂球表皮生長因子8介導的凋亡清除在子宮內膜異位癥發病中的作用

趙宇 胡佳寧 杜心怡 王丹菡 盧曉聲 胡越 張瓊

[摘要] 目的 探討乳脂球表皮生長因子8（MFG-E8）與子宮內膜異位癥發生發展的關系，及其對子宮內膜異位癥的改善作用。 方法 檢測2018年1～6月本院收治的子宮內膜異位癥患者與對照組研究對象的腹腔腹水巨噬細胞的吞噬凋亡細胞能力，以及外周血、腹水及異位腹膜中MFG-E8表達差異;雌性SD大鼠隨機分為模型組、MFG-E8+模型組、MFG-E8組、PBS+模型組和對照組，觀察MFG-E8對異位移植病灶大小的作用，檢測模型腹腔微環境中炎癥因子白細胞介素-6、腫瘤壞死因子、白細胞介素-1β等的表達變化。 結果 子宮內膜異位癥患者腹腔巨噬細胞吞噬功能顯著低于正常對照組;子宮內膜異位癥患者血清MFG-E8濃度為（0.71±0.08）ng/mL顯著低于健康對照志愿者的（0.98±0.11）ng/mL（P<0.05），子宮內膜異位癥患者腹水MFG-E8濃度為（0.40±0.05）ng/mL，顯著低于健康對照志愿者的（0.59±0.07）ng/mL（P<0.05），異位內膜MFG-E8 mRNA 相對表達量顯著低于對照組腹膜組織;重組MFG-E8干預后，能顯著減小內異癥模型的異位移植病灶體積，同時降低腹腔微環境中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。 結論 MFG-E8在子宮內膜異位癥與對照組人群存在表達差異，MFG-E8能改善子宮內膜異位癥。

[關鍵詞] 乳脂球表皮生長因子8;子宮內膜異位癥;凋亡;清除

[中圖分類號] R711.7 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）18-0037-05

The role of milk fat globule epidermal growth factor 8 mediated apoptotic clearance in the pathogenesis of endometriosis

ZHAO Yu1 ? HU Jia'ning2 ? DU Xinyi2 ? WANG Danhan1 ? LU Xiaosheng1 ? HU Yue1 ? ZHANG Qiong1

1.Department of Gynaecology and Obstetrics，the Second Affiliated Hospital & Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou ? 325000， China; 2.The Second School of Medicine， Wenzhou Medical University， Wenzhou ? 325000， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between milk fat globule epidermal growth factor 8（MFG-E8） and the development of endometriosis， and its improvement effect on endometriosis. Methods The phagocytic ability of macrophages towards apoptotic cells in peritoneal ascites， as well as the expression difference of MFG-E8 in peripheral blood， ascites and ectopic peritoneum， was detected in patients with endometriosis and controls in our hospital from January 2018 to June 2018. Female SD rats were randomLy divided into model group， MFG-E8+model group， MFG-E8 group， PBS+model group and control group. The effect of MFG-E8 on the size of ectopic transplantation lesions was observed. The expression changes of inflammatory factors including interleukin-6，tumor necrosis factor， interleukin-1β in the abdominal microenvironment of the model were detected. Results The phagocytic function of peritoneal macrophages in patients with endometriosis was significantly lower than that in the normal control group. The serum MFG-E8 concentration（0.71±0.08 ng/mL） in patients with endometriosis was significantly lower than that in healthy control volunteers（0.98±0.11）ng/mL（P<0.05）. The ascites MFG-E8 concentration in endometriosis patients was（0.40± 0.05）ng/mL，which was significantly lower than that in healthy control volunteers （0.59±0.07）ng/mL （P<0.05）. The relative expression of ectopic endometrium MFG-E8 mRNA was significantly lower than that of the control group. Intervention with recombinant MFG-E8 can significantly reduce the volume of ectopic transplantation lesions in the endometriosis model and reduce inflammatory cytokines TNF-α，IL-1β and IL-6 levels in the abdominal microenvironment. Conclusion MFG-E8 has different expression between endometriosis and control population， which can improve endometriosis.

[Key words] Milk fat globule epidermal growth factor 8; Endometriosis; Apoptosis; Clearance

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMT）是常見的良性婦科疾病，但該病具有侵襲、轉移與復發等惡性行為，嚴重影響育齡期婦女的健康和生活質量[1]，該病的發病率高達30%～50%[2]。但其病因及發病機制仍不清楚。在目前諸多的發病學說中，Sampson的經血逆流學說占主導理論。當經期子宮黏膜碎片逆流入腹腔時，需經歷細胞凋亡，凋亡細胞會被其鄰近細胞以及招募的吞噬細胞快速有效清除。倘若機體內凋亡細胞不能得到及時清除，凋亡碎片長期存在，則可能引起繼發性壞死，釋放促炎介質，繼而誘發慢性炎癥和自身免疫性疾病[3]。

乳脂球表皮生長因子-8（milk fat globule-EGF factor 8，MFG-E8）[4]，最初被發現是作為一個黏附在乳汁脂肪小球膜表面的鑲嵌型外周蛋白，參與機體免疫清除過程及其他細胞間相互作用。吞噬細胞清除凋亡細胞過程中，當吞噬細胞被激活并遇到凋亡細胞后即可分泌MFG-E8。MFG-E8在吞噬細胞和凋亡細胞之間起到橋連作用，加強了凋亡細胞的吞噬清除，對維持機體的內環境穩定起到重要作用。

目前，國內外均未見有關子宮內膜異位癥凋亡清除障礙及其與MFG-E8方面的相關報道，本文旨在探討MFG-E8在子宮內膜異位癥發病中的作用及機制，以期進一步明確子宮內膜異位癥的發生發病機制，尋找該病治療的新靶點，從根本上有效預防和治療子宮內膜異位癥。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

MFG-E8 Elisa試劑盒購自美國R&D Systems公司，TNF-α、IL-1β和IL-6的Elisa試劑盒購自美國的BioLegend公司，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書執行。rMFG-E8購自美國R&D Systems公司。

1.2 研究對象

1.2.1 樣本來源 ?選擇2018年1～6月溫州醫科大學附屬第二醫院收治的子宮內膜異位癥患者40例（EMs組），年齡18～44歲，平均（30.90±6.38）歲，所有子宮內膜異位癥病例均經腹腔鏡或開腹手術，病理檢查結果確診。按1997年第3次修訂的美國生育協會r-AFS分期標準進行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期20例，評分5～14分，平均（9.60±3.20）分，Ⅲ～Ⅳ期20例，評分16～112分，平均（60.60±30.32）分，月經規律，周期28～32 d，無其他內分泌、免疫和代謝性疾病，手術前3個月內未接受激素及抗炎治療;對照組為同期因卵巢囊腫（畸胎瘤、單純囊腫、卵巢冠囊腫等）或宮頸病變等原因行手術，子宮內膜正常，同時排除子宮內膜異位癥的患者，其余條件同子宮內膜異位癥組;收集對照組40例，年齡18～41歲，平均（30.10±6.52）歲。所有患者均簽訂知情同意書，研究經本院倫理委員會批準。

術前抽取患者外周血，用于檢測MFG-E8濃度;術中由手術醫生抽取腹水，用于檢測MFG-E8濃度和巨噬細胞吞噬凋亡細胞能力;并剪取腹膜異位病灶或盆壁處表面光滑、無異常表現的腹膜1×1 cm2大小，術中只夾取腹膜邊緣，不觸及其表面，從左下穿刺孔小心夾出，置于凍存管，進行液氮保存。

1.2.2 實驗動物 ?雌性成熟未孕清潔級SD大鼠50只，實驗前質量為200～250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備 ?SD大鼠適應性喂養7 d，飼養環境：室溫18℃～22℃，相對濕度40%～50%，標準飼料和水飼養。每天同一時間進行陰道涂片（以0.9%生理鹽水沖洗陰道后，吸取少量陰道分泌物涂片鏡檢，鏡下見有大量表層脫落細胞者為動情期），監測并統計大鼠動情規律。選取動情周期規則的SD大鼠40只。手術在無菌環境中進行，以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠1 mL/kg。將大鼠仰臥位固定于手術操作臺上，腹部消毒后做2～3 cm切口，游離右側子宮，剪取靠近卵巢處約1.5 cm一段子宮置入含生理鹽水的培養皿中，將子宮內膜層與子宮肌層分離后，將內膜剪成5 mm×5 mm大小，以可吸收縫線四角縫固于右側腹壁血管交叉處，內膜面貼腹壁。以生理鹽水沖洗腹腔，逐層縫合腹部切口。術后肌注青霉素0.4萬U/只，連續5 d，預防感染。術后大鼠分籠單放，使其自然蘇醒，常規飼養。于術后3周再次開腹。本實驗經溫州醫科大學動物倫理委員會批準。

1.3.2 模型的判定 ?模型建立3周后，對實驗大鼠進行第2次剖腹，用測量尺測量移植物的長、寬、高，并記錄觀察移植物的生長情況與存活情況。子宮內膜異位癥模型建模成功觀察標準：移植灶體積增大（體積大于25 mm3;高度大于1 mm），呈透明的結節狀、囊狀、有澄清液體積聚，移植物被結締組織覆蓋并有血管形成，質地軟。

1.3.3 動物分組及給藥 ?將大鼠飼養1周后，取50只隨機平均分為5組，分別為模型組、MFGE8+模型組、MFGE8組、PBS+模型組和對照組：模型組按建模方法常規建模;MFG-E8+模型組建模后每日腹腔注射15 μg/kg rMFG-E8，持續3周;MFGE8組每日腹腔注射15 μg/kg rMFG-E8，持續3周;PBS+模型組每日腹腔注射rMFG-E8溶解劑PBS 0.1 mL，持續3周;對照組不做任何處理。

1.3.4 觀察異位病灶 ?建模3周，大鼠全部頸椎脫臼法處死，以游標卡尺測量給藥前后各組異位病灶的體積（V=0.52×長×寬×高，mm3）。

1.4 觀察指標

收集40例子宮內膜異位癥患者和40例對照組血清樣本，利用酶聯免疫吸附法（Elisa）檢測血清中MFG-E8濃度;收集各組實驗大鼠腹腔液，分別利用IL-1β、IL-6和TNF-α Elisa 試劑盒檢測腹腔液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書執行。

1.5 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件對本研究中數據進行統計學處理，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間變量比較采用單因素方差分析，組間差異分析采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜異位癥患者與正常對照腹水中巨噬細胞吞噬凋亡細胞能力的情況

本研究檢測了10例子宮內膜異位癥患者和10例非子宮內膜異位癥對照組腹水/腹腔沖洗液中巨噬細胞吞噬凋亡細胞能力的情況，結果發現子宮內膜異位癥患者腹腔巨噬細胞吞噬功能為（35.50±2.10）%，顯著低于對照組的（57.75±3.82）%。見圖1。

2.2 子宮內膜異位癥患者與正常對照MFG-E8表達差異

為確定MFG-E8在子宮內膜異位癥中的作用，本研究收集子宮內膜異位癥臨床樣本及正常對照組，并檢測其血清和腹水MFG-E8的濃度。ELISA檢測結果顯示子宮內膜異位癥患者血清MFG-E8濃度為（0.71±0.08） ng/mL，顯著低于健康對照志愿者（0.98±0.11） ng/mL，P<0.05，圖2A;子宮內膜異位癥患者腹水MFG-E8濃度為（0.40±0.05） ng/mL，顯著低于健康對照志愿者的（0.59±0.07） ng/mL，P<0.05，圖2B。qPCR 法檢測結果顯示，異位內膜MFG-E8 mRNA 相對表達量與對照組腹膜組織比較，差異有統計學意義（P<0.05;圖2C）。

2.3 MFG-E8干預后子宮內膜異位癥模型異位病灶的改變

子宮內膜異位癥主要病理性改變表現為異位內膜病灶體積的變化，觀察病灶部位呈圓形或扁圓形的囊狀，囊內充滿白色或淡黃色透明積液，其表面有血管生長。經rMFG-E8干預后，異位病灶體積對比模型組有減小，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

注：與模型組比較，*P<0.05

2.4 各組腹腔微環境中炎癥因子白細胞介素-6、腫瘤壞死因子、白細胞介素-1β等的表達變化比較

結果顯示，與對照組比較，模型組和MFG-E8+模型組腹腔液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，MFG-E8組大鼠腹腔液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著降低（P<0.05）。見表2。

3 討論

子宮內膜異位癥是育齡期婦女的常見病和多發病，可嚴重影響患者的生活質量和生育能力[5-8]。該病盡管是良性疾病，但具有轉移、浸潤和復發等惡性生物學行為，該病的發病率高達30%～50%。但其病因及發病機制仍不清楚，探討子宮內膜異位癥的發病機制，尋找預防其發病的有效方法和手段，是目前婦科研究的熱點和難點。目前尚無一元論可解釋該疾病的發生機制，多個研究提示子宮內膜異位病灶的形成是一個多因素共同參與的復雜過程[9-12]。

3.1 子宮內膜異位癥凋亡吞噬功能障礙

在目前諸多的發病學說中，Sampson的經血逆流學說占主導理論，其認為經期時子宮內膜腺上皮和間質細胞可隨經血逆流進入盆腔，種植于卵巢和鄰近的盆腔腹膜，并繼續生長形成盆腔內異病灶。但是該理論不能解釋經血逆流是生理現象，卻只有部分婦女發生子宮內膜異位癥。有研究顯示，經血逆流只是誘因，更深層的原因可能是子宮內膜異位癥患者盆腹腔內微環境的改變[13]。然而子宮內膜異位癥患者盆腹腔內微環境變化的始動原因仍不明確。在健康機體中，當經期子宮黏膜碎片逆流入腹腔時，需經歷細胞凋亡，凋亡細胞會被其鄰近細胞以及招募的吞噬細胞快速有效清除，從而避免死亡細胞內容物外流引起的炎癥反應。倘若機體內凋亡細胞不能得到及時清除，凋亡碎片長期存在，則可能引起繼發性壞死，釋放促炎介質，繼而誘發慢性炎癥和自身免疫病[3]。本研究結果提示，子宮內膜異位癥的發生可能與凋亡細胞的清除障礙有關。逆流盆腹腔的內膜細胞發生凋亡，不能被及時有效地清除，繼而發生次級的細胞壞死，細胞核膜和細胞核裂解，細胞解體，釋放出有毒內容物，導致嚴重炎癥，繼而誘使異位子宮內膜細胞發生黏附、種植、侵襲和新生血管的形成，最終表現為子宮內膜異位癥。顯然，凋亡細胞的清除障礙的深入研究將為子宮內膜異位癥病因探索提供新的思路。但是，目前對子宮內膜異位癥的凋亡清除機制障礙的原因仍不清楚。

3.2 子宮內膜異位癥患者與正常對照MFG-E8表達差異

關于MFG-E8，最初被發現它是作為一個黏附在乳汁脂肪小球膜表面的鑲嵌型外周蛋白，由乳腺上皮細胞、巨噬細胞、不成熟樹突狀細胞分泌，參與機體免疫清除過程及其他細胞間相互作用。研究發現在婦科卵巢惡性腫瘤中，MFG-E8的表達量顯著高于正常對照組[14]，且拮抗MFG-E8有明顯的抑癌作用[15]。MFG-E8是一種存在于多種物種體內的親脂性糖蛋白。在機體清除凋亡細胞上起著重要的作用[16]。吞噬細胞清除凋亡細胞過程中，當吞噬細胞被激活并遇到凋亡細胞后即可分泌MFG-E8。MFG-E8在吞噬細胞和凋亡細胞之間起到橋連作用，加強了凋亡細胞的吞噬清除，對維持機體的內環境穩定起到重要作用。研究證實[17，18]，與野生型的動物比較，無MFG-E8分泌的動物體內活化巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬功能減弱。Kamran等[19]研究發現，MFG-E8通過辨認暴露于凋亡上皮細胞表面的絲氨酸與凋亡的上皮細胞結合，并促進吞噬細胞對凋亡細胞的清除，缺乏MFG-E8的小鼠乳腺組織凋亡的細胞數增多，乳腺退化和脂肪細胞再生受阻，并隨乳腺退化的進行，乳腺組織出現炎癥。凋亡細胞碎片的吞噬清除對維持機體內環境的穩定及激活抗炎通路是至關重要的。本研究結果顯示，子宮內膜異位癥患者外周血、腹水及腹膜病灶和正常對照比較，MFG-E8的含量及mRNA的表達顯著降低，提示MFG-E8可能在介導子宮內膜異位癥的凋亡細胞清除過程中起重要作用。

3.3 MFG-E8與子宮內膜異位癥發病的關系

在確認MFG-E8在子宮內膜異位癥和正常對照存在表達差異的基礎上，為深入探討MFG-E8在子宮內膜異位癥中的意義，本研究予重組MFG-E8干預子宮內膜異位癥動物模型，結果發現，應用MFG-E8后，異位移植病灶顯著縮小。顯然，對介導凋亡細胞的清除的MFG-E8的深入研究為探索子宮內膜異位癥的病因提供了新線索。凋亡細胞碎片的吞噬清除對維持機體內環境的穩定及激活抗炎通路是至關重要的。進一步檢測炎癥因子，結果發現，炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在子宮內膜異位癥模型中顯著增加，MFG-E8干預后，能使子宮內膜異位癥模型大鼠腹腔液中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6顯著降低，具有明顯抑制腹腔微環境中炎癥反應作用。盆腹腔內異位病灶周圍有大量促炎因子存在。微環境中的促炎性細胞因子及生長因子[10-22]，如白細胞介素-6，腫瘤壞死因子，白細胞介素-1β等增加了細胞的增殖，促進了異位組織的粘連及細胞黏附分子的脫落，促進形成新生血管。由此可見，盆腹腔微環境與子宮內膜異位癥發生發展關系密切。提示，MFG-E8通過介導凋亡細胞的有效清除，進而抑制炎癥因子，改善子宮內膜異位癥的發生發展。

本研究首次闡述子宮內膜異位癥存在凋亡細胞清除障礙現象的存在，并揭示了MFG-E8與子宮內膜異位癥發病的關系，探討通過MFG-E8來防治子宮內膜異位癥的發生的可行性，尋找該病治療的新靶點，從根本上有效預防和治療子宮內膜異位癥。

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（收稿日期：2020-02-05）