多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r系統的表達及作用研究

劉冉冉 駱倩倩 孫曉娟

[摘要] 目的 建立多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠模型，探討卵巢組織中kisspeptin/kiss1r系統表達及作用。 方法 孕10 d的Wistar大鼠20只，其雌性后代60只，根據隨機數字表法分為PCOS組和正常組，每組30只。PCOS組給予來曲唑和羧甲基纖維素（CMC）連續灌胃21 d，正常組給予等體積的CMC灌胃。造模結束后檢測兩組大鼠體重參數和血清激素水平;HE染色檢測卵巢組織形態學改變;免疫組織化學染色和qRT-PCR檢測卵巢組織中kisspeptin和kiss1r的表達。 結果 與正常組比較，PCOS組大鼠的體重、腹膜后脂肪含量、卵巢重量均增加，血清黃體生成素、卵泡刺激素和睪酮水平均升高（P < 0.05或P < 0.01）。與正常組比較，PCOS組大鼠卵巢中kiss1-mRNA表達降低（P < 0.05）;兩組大鼠卵巢中kiss1r-mRNA表達比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。PCOS組大鼠卵巢具有典型的多囊樣改變。 結論 PCOS大鼠卵巢可見kisspeptin/kiss1r系統的低表達，可能在PCOS的發生、發展中起重要作用。

[關鍵詞] 多囊卵巢綜合征;Kisspeptin/kiss1r系統;卵巢;來曲唑

[中圖分類號] R711.75 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（a）-0016-04

[Abstract] Objective To establish a rat model of polycystic ovary syndrome （PCOS） and investigate the expression and function of kisspeptin/kiss1r system in ovarian tissue. Methods Twenty Wistar rats at the 10th day of gestation were divided into PCOS group and normal group according to the random number table method， with 30 rats in each group. In PCOS group， Letrozole and carboxy methyl cellulose （CMC） were administered continuously for 21 days， while in normal group， CMC of equal volume was administered. Body weight parameters and serum hormone levels of two groups were measured after model establishment; the ovarian histomorphology was detected by HE staining; the expression of kisspeptin and kiss1r in the ovarian tissue was detected by immunohistochemistry and qRT-PCR. Results Compared with normal group， the weight， the content of retroperitoneal fat and the weight of ovary in PCOS group were increased， and the levels of serum luteinizing hormone， follicle stimulating hormone and testosterone were increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with normal group， the expression of kiss1-mRNA in the ovaries of PCOS group was decreased （P < 0.05）. There was no significant difference in kiss1r-mRNA expression between two groups （P > 0.05）. PCOS group showed typical polycystic changes in ovaries. Conclusion Down-regulation of kisspeptin/kiss1r system in the ovaries of PCOS rats may play an important role in the occurrence and development of PCOS.

[Key words] Polycystic ovarian syndrome; Kisspeptin/kiss1r system; Ovary; Letrozole

多囊卵巢綜合征（PCOS）是臨床上最常見的內分泌紊亂性疾病，多伴有卵泡發育異常和雄激素增多[1]，造成閉經、不育、多毛、肥胖等[2]。由于發病率高，治療困難，增加腫瘤[3]的發生，PCOS成為重要的研究課題。目前對PCOS病因的研究較多，大多與下丘腦-垂體-性腺軸有關。kisspeptin/kiss1受體（kiss1r）系統是此軸最強有力的影響因素[4]。kisspeptin是由kiss1基因編碼的神經肽前體，可以結合并激活其受體kiss1r，并發揮作用。食源性肥胖大鼠下丘腦中的kisspeptin表達減少[5]，導致生殖障礙，營養不良、糖尿病等均會引起下丘腦kisspeptin/kiss1r系統的異常表達[6]。在PCOS大鼠中，下丘腦kiss1基因和kisspeptin表達均有顯著改變[7-8]。本研究主要探究kisspeptin/kiss1r系統在多囊卵巢中的作用，以了解其發病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號：SCXK（魯）20190003，實驗設計和開展情況符合濱州醫學院煙臺附屬醫院醫學倫理委員會的倫理要求。病理圖像分析儀（萊卡）;Rotor Gene-3000PCR儀（德國QIAGEN）;酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒[上海酶聯生物，黃體生成素（LH）：002860;卵泡刺激素（FSH）：002872;睪酮（T）：003368];免疫組織化學染色試劑盒（Bioworld，05100）;PCR試劑盒（Roche，11636103001）。

1.2 分組及模型制備

孕10 d的Wistar大鼠20只，產后60只雌鼠按1～60編號，依據隨機數字表法分為PCOS組和正常組。PCOS組30只大鼠每日用來曲唑（1 mg/kg）溶于1%的羧甲基纖維素（CMC）溶液連續灌胃21 d;正常組30只大鼠給予等體積的CMC溶液灌胃。造模結束后，大鼠的激素改變、卵巢的典型多囊樣與臨床PCOS患者一致，表明造模成功。

1.3 動物取材

造模結束后，稱重，測身長（鼻尖至肛門的距離），麻醉，心尖部取血，得血清備用;剝離腹膜后脂肪稱重;部分大鼠取新鮮卵巢組織;剩余大鼠用多聚甲醛心內灌流固定卵巢組織，備用。

1.4 ELISA檢測血清激素水平

按ELISA試劑盒檢測血清LH、FSH和T水平。

1.5 蘇木精-伊紅（HE）染色檢測卵巢形態學改變

將多聚甲醛固定后的卵巢，按照步驟，經脫水、透明、包埋、切片、HE染色等一系列過程，觀察卵巢的形態學改變。

1.6 免疫組織化學染色檢測卵巢中kisspeptin和kiss1r的表達

將石蠟包埋的卵巢組織蠟塊，經切片、脫蠟至水。一抗選用兔抗kisspeptin多克隆抗體，兔抗kiss1r多克隆抗體，二抗選用生物素化羊抗兔IgG（1∶200），DAB顯色，經脫水、透明、封片、鏡檢。

1.7 qRT-PCR檢測卵巢中kiss1-mRNA和kiss1r-mRNA的表達

新鮮卵巢液氮研磨提取總RNA，逆轉錄得cDNA。制備β-actin、kiss1和kiss1r引物序列。kiss1：上游5′-CACCTGTGGTGAACCCTGAA-3′，下游5′-GACGAAT-TTGCACATGAAGTCTCC-3′;kiss1r：上游5′-AGCAC-ATGCAGACCGTCACC-3′，下游5′-GACGAATTTGC-ACATGAAGTCTCC-3′。預變性95℃×30 s，1個循環;PCR反應：95℃×5 s，60℃×20 s，40個循環。以β-actin為內參，采用Rotor Gene-3000進行擴增定量，以相對定量法分析數據。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠體重參數和血清激素水平比較

與正常組比較，PCOS組大鼠的體重、腹膜后脂肪含量、卵巢重量均增加（P < 0.05或P < 0.01），血清LH、FSH和T水平均升高（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.2 兩組大鼠卵巢的形態學改變

正常組大鼠卵巢可見多個卵泡，卵母細胞、透明帶和放射冠清晰可見，次級卵泡、成熟卵泡均正常;PCOS組大鼠卵巢可見數十個囊狀擴張的卵泡，卵母細胞和放射冠減少或消失。見圖1。

2.3 兩組大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r系統的表達

卵巢中kisspeptin/kiss1r系統在胞質中呈棕黃色著色，邊界清晰。kisspeptin主要表達于顆粒細胞和膜細胞，kiss1r的陽性信號多見于顆粒細胞。分析顯示，與正常組比較，PCOS組大鼠卵巢組織kisspeptin和kiss1r陽性細胞數量減少，胞質著色淡，含量均減少。見圖2（封四）。

2.4 兩組大鼠卵巢中kiss1-mRNA和kiss1r-mRNA的表達

與正常組比較，PCOS組大鼠卵巢中kiss1-mRNA表達降低（P < 0.05）;兩組大鼠卵巢中kiss1r-mRNA表達比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3。

3 討論

PCOS是無排卵性不孕的最常見原因，發病率為25%～30%[9]，多見閉經、多毛、肥胖、不孕和卵巢多囊樣改變。本實驗用來曲唑構建大鼠的PCOS模型，來曲唑可抑制芳香化酶的功能，減弱睪酮和雄烯二酮轉變成雌二醇和雌酮[10]的能力，導致雄激素水平升高。卵巢中高雄激素使卵泡發育停滯，無優勢卵泡出現和持續性不排卵，是本課題中建立PCOS模型的理論基礎。

造模結束后，大鼠的體重、腹膜后脂肪和卵巢重量顯著增加，血清LH、FSH和T水平升高，HE染色后可見卵巢結構紊亂，呈典型的多囊樣，因此用來曲唑造?？梢宰鳛镻COS模型進行后續研究。

PCOS的致病機制尚不能確定，多與HPG軸的功能紊亂有關。kisspeptin是HPG軸最直接的啟動點[11]。營養不良[12]、禁食[13]、糖尿病[14]等均會引起下丘腦kiss1-mRNA的表達減少。PCOS大鼠的下丘腦kisspeptin/kiss1r系統中蛋白和基因表達有明顯改變，可能通過調節HPG軸的功能發揮作用。卵巢組織局部的kiss-peptin不僅在下丘腦發揮作用，而且還能調節卵巢的功能[15]。向體外培養卵巢黃體細胞加入外源性kissp-eptin，孕酮升高[16]，同時激活Erkl/2信號途徑[17]，由此證明，kisspeptin可直接影響卵巢功能。PCOS組大鼠卵巢組織中kisspeptin和kiss1r的低表達，可能導致卵泡的生長發育存在明顯缺陷[18]。kisspeptin處理黃素化的顆粒細胞后，促使顆粒細胞增殖分化，分泌雌激素和孕激素增加[19]。在PCOS大鼠卵巢中，顆粒細胞數量減少或功能減低，可能與低表達的kisspeptin/kiss1r系統有關。有研究將kisspeptin用于誘導排卵[20]，發現其能減少促排卵過程中卵巢過度刺激綜合征的發生。

綜上所述，kisspeptin/kiss1r系統與PCOS的發生、發展存在潛在的聯系，為深入研究PCOS的發病機制提供一定的理論基礎，并為臨床治療提供有利線索。

[參考文獻]

[1] ?Di Pietro M，Pascuali N，Parborell F，et al. Ovarian angiogenesis in polycystic ovary syndrome [J]. Reproduction，2018，155（5）：R199-R209.

[2] ?王秋毅，黃薇.重視多囊卵巢綜合征代謝紊亂問題[J].實用婦產科雜志，2018，34（8）：564-566.

[3] ?畢紅，李衛文，曹森楊，等.多囊卵巢綜合征患者血清腫瘤壞死因子-α和抗苗勒管激素水平及其與疾病的相關性分析[J].婦女保健，2018，33（19）：4363-4365.

[4] ?Skorupskaite K，George JT，Anderson RA. The kisspeptin-GnRH pathway in human reproductive health and disease [J]. Hum Reprod Update，2014，20（4）：485-500.

[5] ?劉冉冉，張洪芹.Kisspeptin/kiss1r系統在營養性肥胖雄性大鼠下丘腦弓狀核的表達以及對下丘腦-垂體-睪丸軸的影響[J].中華男科學雜志，2014，20（9）：792-797.

[6] ?Tng EL. Kisspeptin signalling and its roles in humans [J]. Singapore Med J，2015，56（12）：649-656.

[7] ?Aliabadi E，Namavar MR，Mortezaee K. Kisspeptin expression features in the arcuate and anteroventral periventricular nuclei of hypothalamus of letrozole-induced polycystic ovarian syndrome in rats [J]. Arch Gynecol Obstet，2017，296（5）：957-963.

[8] ?駱倩倩，劉冉冉，張冬梅，等. Kisspeptin/Kiss1r系統在多囊卵巢綜合癥大鼠下丘腦弓狀核的表達[J].中國計劃生育學雜志，2014，22（5）：304-308.

[9] ?劉麗偉.C-FOS、STAT3、Ub在PCOS患者著床窗口期子宮內膜的表達及意義[D].鄭州：鄭州大學，2016.

[10] ?Kakadia N，Patel P，Deshpande S，et al. Effect of Vitex negundo L. seeds in letrozole induced polycystic ovarian syndrome [J]. J Tradit Complement Med，2018，9（4）：336-345.

[11] ?Trevisan CM，Montagna E，de Oliveira R，et al. Kisspeptin/GPR54 system：what do we know about its role in human reproduction？ [J]. Cell Physiol Biochem，2018，49（4）：1259-1276.

[12] ?Roa J，Barroso A，Ruiz-Pino F，et al. Metabolic regulation of female puberty via hypothalamic AMPK-kisspeptin signaling [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2018，15（45）：E10758-E10767.

[13] ?Harter Campbell JL，Kavanagh GS，Smith JT. The role of kisspeptin neurons in reproduction and metabolism [J]. J Endocrinol，2018，238（3）：R173-R183.

[14] ?Dudek M，Ko？覥odziejski PA，Pruszyńska-Oszma？覥ek E，et al. Effects of high-fat diet-induced obesity and diabetes on Kiss1 and GPR54 expression in the hypothalamic-pituitary-gonadal （HPG） axis and peripheral organs （fat，pancreas and liver） in male rats [J]. Neuropeptides，2016， 56：41-49.

[15] ?Hu KL，Zhao H，Chang HM，et al. Kisspeptin/kisspeptin receptor system in the ovary [J]. Front Endocrinol （Lausanne），2018，8：365.

[16] ?Maranesi M，Petrucci L，Leonardi L，et al. Kisspeptin/kisspeptin receptor system in pseudopregnant rabbit corpora lutea：presence and function [J]. Sci Rep，2019，9（1）：5044.

[17] ?Peng J，Tang M，Zhang BP，et al. Kisspeptin stimulates progesterone secretion via the Erk1/2 mitogen-activated protein kinase signaling pathway in rat luteal cells [J]. Fertil Steril，2013，99（5）：1436-1443.

[18] ?Liu H，Xu G，Yuan Z，et al. Effect of kisspeptin on the proliferation and apoptosis of bovine granulosa cells [J]. Anim Reprod Sci，2017，185：1-7.

[19] ?郭威.Kisspeptin參與多嚢卵巢綜合征患者顆粒細胞孕激素分泌的調節[D].鄭州：鄭州大學，2015.

[20] ?翟君鈺.Kisspeptin與卵巢功能及排卵的關聯性研究[D].濟南：山東大學，2014.

（收稿日期：2019-08-08）