新疆阿魏RNA提取的不同方法比較

劉歡歡 賴曉輝

摘? ? 要：以新疆阿魏葉片為材料，采用3種不同的方法分別提取其總RNA，用核酸蛋白檢測儀、瓊脂糖凝膠電泳方法檢測其濃度、純度及完整性，旨在建立提取新疆阿魏總RNA的最適方法，為后續深入研究新疆阿魏生物合成途徑及機制奠定基礎。結果表明：3種方法均能提取出新疆阿魏葉片總RNA。試劑盒法提取的總RNA質量最好，28S RNA亮度是18S RNA的2倍，條帶清晰，操作簡單，耗時短;Trizol法提取的RNA質量次于試劑盒法，且過程中無法判斷次級代謝產物對RNA提取的影響，Trizol裂解液存在毒性物質;改良CTAB法提取的總RNA質量較差，無法滿足下一步試驗的要求，操作復雜，耗時較長。因此，試劑盒法為提取新疆阿魏RNA最佳方法。以試劑盒法提取的總RNA為模板進行PCR檢測，得到的擴增條帶清晰，與目的片段大小一致，進一步證明此方法提取的總RNA質量能夠滿足后續試驗的要求。

關鍵詞：新疆阿魏;RNA提取;比較

新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）系傘形科阿魏屬植物，多年生一次結實類短命草本[1-2]。 生長于內陸干旱荒漠地區，中國僅見于新疆西部地區（現僅分布于伊犁市伊寧縣喀什鄉），主要用作鎮靜、鎮痛及關節疼痛，治療腸胃氣脹等其它神經疾患。是具有重要藥用價值的珍稀植物資源，為國家二級保護植物[3-4]。由于人們長期過度開采及農牧民過度放牧、偷伐盜割，加之植物種子本身存在休眠且繁殖率低，種群數量連年減少，現已極度瀕危。

目前， 已經建立了不同植物的多種RNA提取方法[5-7]，但關于新疆阿魏總RNA提取的研究尚未見報道。通過現代生物技術手段深入了解新疆阿魏特殊的生長規律及藥用成分的生物合成途徑，從而達到藥用成分增產或植物保護的目的。對于特定的材料和不同的實驗環境，需要從材料內次級代謝產物對總RNA提取質量產生的影響、可利用的試劑、資金等方面考慮從而做出不同的選擇，對于現有的實驗室條件，本試驗所選取的試劑盒法，Trizol法和CTAB法仍然是提取新疆阿魏RNA不同方法的最佳對比選擇。建立新疆阿魏總RNA提取的最適方法，提取高質量的新疆阿魏葉片RNA是對植物組織進行分子水平研究的必要前提，可為后續深入研究新疆阿魏生物合成途徑及機制奠定基礎。

1? ? ?材料與試劑

1.1? ?材料

4月下旬在伊寧縣喀什鎮拜石墩農場北向礫石質山坡新疆阿魏生長地采樣，剪取新疆阿魏葉片，暫時保存在冰盒中，帶回實驗室立即液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。

1.2? ?試劑

通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）RP3301，液氮，Trizol提取液、DEPC、改良CTAB緩沖液、β-巰基乙醇、瓊脂糖等及分析純試劑。檢測引物AL/AR由華大基因（北京）公司完成。

為防止RNA降解，離心步驟均在4℃下進行，提取RNA全程使用無RNA酶槍頭、離心管;槍頭盒、研缽、鑰匙、量筒等玻璃器皿均需用0.1%的DEPC水浸泡過夜，之后121℃滅菌30min備用，實驗儀器需75%酒精消毒，使用實驗室提取RNA專用的電泳槽、梳子等。

2? ? ?方法

2.1? ?總RNA提取法

2.1.1? 通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）。采用北京百泰克生物技術有限公司生產的通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）RP3301，RNA提取方法步驟參考說明書進行。

2.1.2? 改良CTAB法。㏑1.5mL離心管中加入1mL CTAB裂解液65℃提前預熱20min;②稱取0.2g新疆阿魏葉片在液氮中研磨至粉末狀后迅速轉移至盛有1mL CTAB裂解液（加入2%β-巰基乙醇）的離心管中，震蕩30～60s;③65℃溫浴40min，期間晃動3～4次，4℃，12000r/min，離心15min;④取上清液，轉移至新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24︰1），抽提，4℃，12000r/min，離心15min;⑤取上清液，重復步驟③;⑥取上清轉移至新離心管中，加入等體積的4mol/L LiCl，4℃沉淀過夜。⑦4℃，12000r/min離心30min后棄上清液，加400μl無水乙醇清洗2次;⑧加入40μl的RNAse-free水溶解沉淀，轉移至新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24︰1），4℃，12000r/min，離心15min;⑨取上清液，轉移至離心管中，加入1/10體積3mol/L NaAc（pH=5.2）和2倍體積無水乙醇，-80℃放置30min，4℃，1200r/min，離心30min;⑩棄上清液，沉淀用400μl無水乙醇清洗2次，干燥，加入20μl的RNAse-free水溶解沉淀，并迅速放置在-20℃下保存。

2.1.3? Trizol法。操作步驟參照胡小蓉等[8]以及Trizol說明書進行。

2.2? RNA檢測方法

2.2.1? 微量核酸蛋白儀測定RNA濃度。分別取3種方法提取的待檢測RNA 1μl，并以1μl RNase-free水為空白對照，用微量核酸蛋白測定儀測RNA濃度及OD260/OD280比值。OD260/OD280比值范圍在1.8～2.1表示提取RNA質量良好;小于1.8時，RNA溶液中存在蛋白或者其他有機物的污染;大于2.1時，說明RNA出現降解。

2.2.2? 總RNA電泳檢測。分別取3種方法提取的待檢測RNA 2μl，加入6×loading buffer 1μl，混勻后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（電壓120v，電泳15～20min），在紫外成像儀下檢測完整性。條帶28S和18S清晰銳利，并且28S的亮度在18S條帶的2倍以上，由此認為RNA的質量良好。