三氧化二砷對肝癌細胞順鉑化療敏感性的調節作用

朱沛楓 唐成武 費卯云

[摘要] 目的 探討三氧化二砷（ATO）對肝癌（HCC）細胞對順鉑（CDDP）化療敏感性的調節作用。 方法 采用HCC細胞（HepG2細胞），根據處理方法，將細胞分為3組：采用5 μM的ATO 聯合20 μM 的CDDP聯合（聯合組）或單獨采用20 μM 的CDDP處理（CDDP組）HCC細胞（HepG2細胞）48 h，對照組采用生理鹽水處理細胞。采用MTT法檢測各組HepG2細胞的增殖率。采用流式細胞儀檢測各組HepG2細胞凋亡情況。比較ATO對CDDP處理后肝癌細胞增殖率及凋亡率的影響。 結果 經過48 h處理，聯合組細胞增殖率明顯低于CDDP組[（0.48±0.05）vs.（0.62±0.06）] （P=0.0002）。經過48 h處理，聯合組細胞凋亡率明顯高于CDDP組[（44.32±3.59） vs.（34.63±3.25）]（P=0.0001）。 結論 ATO聯合CDDP處理可以通過降低HCC細胞增殖率并促進細胞凋亡增加HCC細胞對CDDP化療的敏感性，增強CDDP對肝癌細胞的殺傷力。

[關鍵詞] 肝細胞癌;順鉑;化療敏感性;三氧化二砷

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）19-0029-04

Regulatory effect of arsenic trioxide on cisplatin chemotherapy sensitivity of hepatocarcinoma cells

ZHU Peifeng? ?TANG Chengwu? ?FEI Maoyun

Department of Surgery， the First People's Hospital Affiliated to Huzhou Teachers College， Huzhou? ?313000， China

[Abstract] Objective To investigate the regulatory effect of arsenic trioxide（ATO） on the sensitivity of liver cancer（HCC） cells to cisplatin（CDDP） chemotherapy. Methods HCC cells（HepG2 cells） were divided into 3 groups according to the treatment method： HCC cells treated with 5 μM ATO combined with 20 μM CDDP（the combined group） or HCC cells treated with 20 μM CDDP alone（HepG2 cells）（CDDP group） for 48 hours. The control group was treated with physiological saline. The proliferation rate of HepG2 cells in each group was detected by MTT assay. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of HepG2 cells. The effect of ATO on the proliferation rate and apoptosis of hepatoma cells after CDDP treatment were compared. Results After 48 hours of treatment， the cell proliferation rate of the combined group was significantly lower than that of the CDDP group（0.48±0.05） vs.（0.62±0.06）， （P=0.0002）. After 48 hours of treatment， the apoptosis rate of the combined group was significantly higher than that of the CDDP group（44.32±3.59） vs.（34.63±3.25）， （P=0.0001）. Conclusion ATO combined with CDDP treatment can increase the sensitivity of HCC cells to CDDP chemotherapy by reducing the proliferation rate of HCC cells and promote apoptosis， and enhance the lethality of CDDP on liver cancer cells.

[Key words] Hepatocellular carcinoma; Cisplatin; Chemosensitivity; Arsenic trioxide

肝細胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我國目前發病率第三、致死率第二的惡性腫瘤，已經成為嚴重危害國民健康的公共衛生難題[1-3]。手術切除是除肝移植之外針對肝癌目前最有效的治療手段[4]。雖然目前對肝癌的診治手段有了長足的發展，但是在新確診的肝癌患者中約有2/3屬于晚期，已失去根治性手術的機會，這部分患者需要接受化療為主的非手術治療[5]。順鉑（Cisplatin，CDDP）是第一代鉑類廣譜抗腫瘤藥物，是消化道腫瘤最常用的化療用藥，在胃癌、結直腸癌、肝癌等腫瘤的輔助治療中具有重要的地位[6-8]。然而HCC極易對CDDP產生耐藥，導致化療失敗，縮短了肝癌患者預后[9，10]。因此需要探索一種新的治療策略，減少HCC的化療耐藥，從而改善HCC患者預后。三氧化二砷（Arsenic trioxide，ATO）為砒霜的提取物，已有研究證明其在肝癌治療中能提升化療效果[11]，但其機制尚不明確，本研究擬通過ATO聯合CDDP聯合處理HCC細胞，觀察其對HCC細胞增殖率及凋亡情況的影響，闡明其作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人肝細胞肝癌HepG2 購自上海細胞庫。

1.2 主要試劑

胎牛血清、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜、5%BSA封閉液、MTT試劑盒和三氧化二砷購自美國Sigma公司，DMEM-F12培養基、0.25%胰蛋白酶、10 000 U/mL青霉素/10 000 U/mL鏈霉素購自美國Gibco公司，細胞培養皿及培養板購自美國Coming公司，Annexin Ⅴ凋亡試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測細胞增殖率? 將常規培養的HepG2肝癌細胞株制成細胞懸液，調整濃度為2×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。將對照組、聯合組和CDDP組的HepG2細胞分別用生理鹽水、5 μM的ATO 聯合20 μM 的CDDP和單獨20 μM 的CDDP 處理48 h后終止培養，用PBS清洗3次，加入10 μL MTT溶液，37℃，避光孵育2 h。以酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）值（A值）。

1.3.2 細胞凋亡檢測? 將常規培養的HepG2肝癌細胞株制成細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。將對照組、聯合組和CDDP組的HepG2細胞分別用生理鹽水、5 μM的ATO 聯合20 μM 的CDDP和單獨20 μM的CDDP 處理48 h后，用0.25%的胰酶消化收集細胞，加入完全培養基終止消化，2000 g/min離心3 min，棄上清。用0.01 M PBS清洗細胞，2000 g/min離心3 min，棄上清，重復兩次。吸干PBS，加入Binding Buffer調整細胞濃度，使之成為細胞濃度約為1×106 cells/mL的懸浮液。向調整好的100 μL細胞懸浮液加入2 μL Annexin Ⅴ和2 μL PI，混合后室溫避光孵育15 min。加入400 μL稀釋好的Binding Buffer，用流式細胞儀分析細胞的凋亡情況。

1.4 統計學方法

所有統計均由SPSS 21.0統計學軟件完成，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;P<0.05為差異有統計學意義，直方圖均采用Sigma Plot 10.0繪制。所有實驗均在同等條件下設置8個復孔，保證實驗可重復性。

2 結果

2.1 ATO對肝癌細胞增殖率的影響

經過48 h處理，聯合組細胞增殖率（100%）明顯低于對照組[（0.48±0.05） vs.（0.91±0.08）]，（t=12.8919，P=0.0000）;CDDP組細胞增殖率明顯低于對照組[（0.62±0.06）vs.（0.91±0.08）]（t=8.2024，P=0.0000）;聯合組細胞增殖率明顯低于CDDP組[（0.48±0.05）vs.（0.62±0.06）]（t=5.0700，P=0.0002），表明ATO能明顯增加肝癌細胞對CDDP的敏感性，使肝癌細胞增殖率明顯下降（圖1）。

2.2 ATO對肝癌細胞凋亡率的影響

經過48 h處理，聯合組細胞凋亡率明顯高于對照組[（44.32±3.59）vs.（15.22±1.61）]（t=20.9194，P=0.0000）;CDDP組細胞凋亡率明顯高于對照組[（34.63±3.25）vs.（15.22±1.61）]（t=15.1367，P=0.0000）;聯合組細胞凋亡率明顯高于CDDP組[（44.32±3.59）vs.（34.63±3.25）]（t=5.6597，P=0.0001），表明ATO能明顯增加CDDP對肝癌細胞的殺傷力，使肝癌細胞凋亡率明顯升高（圖2）。

3 討論

肝癌是我國目前最常見的惡性腫瘤之一，在我國肝癌發病率約為26.63/10萬，每年死于肝癌的人數約為31.6萬，占據全世界肝癌死亡人數的一半以上[1]。手術切除是目前除肝移植之外針對肝癌最有效的治療手段[4]。雖然目前對肝癌的診治手段有了長足的發展，但是在新確診的肝癌患者中約有2/3屬于晚期，已失去根治性手術的機會，這部分患者需要接受化療為主的非手術治療[5]。

對于失去手術機會的患者，經動脈化療栓塞（Transarterial chemoembolization，TACE）已被確立為不可切除肝癌患者的標準治療方法[12]。TACE通過結合靶向化療和動脈栓塞引起的缺血性壞死的療效，可以減緩腫瘤進展，提高生存率。TACE治療的生存優勢已被多項隨機臨床試驗證實[13，14]。順鉑（CDDP）是治療消化道惡性腫瘤最有效的藥物之一，廣泛應用于臨床。通過TACE將CDDP與碘油的混合乳劑用于不可切除肝癌的治療，能顯著改善患者預后。然而HCC極易對CDDP產生耐藥，導致化療失敗，縮短了肝癌患者預后[9，10]。因此需要探索一種新的治療策略，減少HCC的化療耐藥，從而改善HCC患者預后。

近期研究發現，部分HCC患者在化療初期就出現化療耐藥，而不是在重復化療后，這表明HCC可能擁有天然的高度耐藥屬性[15]。有研究發現支鏈氨基轉移酶（Branched chain aminotransferase-1，BCAT1）在HCC組織和細胞系中表達明顯上調，對細胞周期有調節作用，參與細胞增殖、分化和凋亡，而且能上調介導HCC的CDDP耐藥[16，17]。BCAT1目前已被證實參與肝癌、胃癌、結腸癌等腫瘤的發生和發展進程[18-20]。在肝癌中，BCAT1的過表達往往預示著較差的預后和較早的術后轉移，其機制可能是BCAT1能起到促肝癌細胞增殖和CDDP化療耐藥的作用，通過阻斷BCAT1表達能明顯改善肝癌細胞的化療耐藥[21]。

ATO為砒霜的提取物，已廣泛用于急性早幼粒細胞白血病的治療[22]，目前已有研究證明其在多種腫瘤中起到治療作用[23-25]。在肝癌中，ATO同樣能起到提升化療效果的作用[11]。有學者將三氧化二砷與TACE聯合治療晚期HCC，顯著提高了化療療效，改善了患者預后[26]。目前，針對ATO提高肝癌細胞化療敏感性的研究仍處于起步階段，有學者發現，ATO能抑制肝癌細胞BCAT1表達，從而提升肝癌細胞對CDDP的化療敏感性[27]。本研究發現，ATO聯合CDDP處理肝癌細胞后顯著降低了肝癌細胞增殖率，并提高了肝癌細胞凋亡率，這表明ATO能顯著增加肝癌細胞對CDDP的化療敏感性。因此，本研究結果進一步證實了ATO在肝癌治療中的作用，為克服HCC對CDDP耐藥、改善CDDP化療的效果，提供了新的理論依據和策略，具有重要的臨床意義

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（收稿日期：2019-07-17）