AGAP2-AS1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

何劉　吳深寶

[摘要] 目的 探究AGAP2-AS1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。 方法 從美國(guó)TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)直腸數(shù)據(jù)下載結(jié)腸癌患者的RNA-Seq數(shù)據(jù)。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得356例結(jié)直腸癌，145例健康樣本，通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR（Polymerase Chain Reaction）檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常腸黏膜上皮細(xì)胞AGAP2-AS1表達(dá)水平。用siRNA（Small interfering RNA）抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中AGAP2-AS1的表達(dá)，再次分析其細(xì)胞增殖、凋亡的改變。 結(jié)果 AGAP2-AS1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)均顯著增加。抑制AGAP2-AS1后腫瘤細(xì)胞增殖能力顯著降低，凋亡顯著增加（P<0.05）。 結(jié)論 AGAP2-AS1在結(jié)腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)，抑制AGAP2-AS1表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌;AGAP2-AS1;增殖;凋亡

[中圖分類號(hào)] R735.35 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）23-0020-04

Effects of AGAP2-AS1 on proliferation and apoptosis of colon cancer cells

HE Liu ? WU Shenbao

Department of Gastroenterology， Yiwu Central Hospital in Zhejiang Province， Yiwu ? 322000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of AGAP2-AS1 in colon cancer and its effect on the proliferation and apoptosis of colon cancer cells. Methods The colorectal cancer RNA-Seq data were downloaded from The Cancer Genome Atlas（TCGA） database. A total of 356 cases of colorectal cancer and 145 healthy samples were obtained from TCGA. The expression of AGAP2-AS1 in colorectal cancer cells and normal intestinal epithelial cells was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction（PCR）. Small interfering RNA（siRNA） was used to inhibit the expression of AGAP2-AS1 in colorectal cancer cells， and the changes of its proliferation and apoptosis were further analyzed. Results The expression of AGAP2-AS1 was significantly increased in colon cancer tissues and cells. After AGAP2-AS1 was inhibited， the proliferation of tumor cells was significantly reduced and apoptosis was significantly increased（P<0.05）. Conclusion AGAP2-AS1 is highly expressed in colon cancer cell lines. Inhibition of AGAP2-AS1 expression can inhibit the proliferation of colon cancer cells and induce their apoptosis.

[Key words] Colon cancer; AGAP2-AS1; Proliferation; Apoptosis

結(jié)腸癌（Colorectal cancer，CRC）作為消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤之一，發(fā)生率僅次于肺癌和肝癌，在我國(guó)及全世界都非常常見(jiàn)，每年我國(guó)死于結(jié)腸癌的患者10萬(wàn)以上，且結(jié)腸癌患者的死亡率有逐漸上升的趨勢(shì)[1]。現(xiàn)在隨著醫(yī)療、衛(wèi)生技術(shù)的飛速發(fā)展，新的診療技術(shù)不斷出現(xiàn)，結(jié)腸癌的診治水平有了明顯提高。然而，由于目前人們還缺乏體檢意識(shí)，且早期結(jié)腸癌并無(wú)明顯特征性表現(xiàn)，故眾多患者在確診結(jié)腸癌時(shí)已經(jīng)處于晚期，且伴多處轉(zhuǎn)移，對(duì)于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的患者來(lái)說(shuō)，以往多采用單純化療，然而療效往往不盡人意[2]，近年來(lái)，靶向治療作為一種新興的治療方式正在逐漸被臨床醫(yī)師所認(rèn)可，因此特異性生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究顯得十分重要[3]。

AGAP2-AS1是一種定位于12q14.1的反義lncRNA（long noncoding RNA），現(xiàn)有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AGAP2-AS1在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)失調(diào)，并與惡性腫瘤的臨床預(yù)后相關(guān)。然而，AGAP2-AS1在CRC中的表達(dá)及其作用報(bào)道較少[4]。因此，本研究旨在探究AGAP2-AS1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 TCGA結(jié)直腸RNA-Seq數(shù)據(jù)

從美國(guó)TCGA（The Cancer Genome Atlas） 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)直腸數(shù)據(jù)下載結(jié)腸癌患者的RNA-Seq數(shù)據(jù)[5]。

1.2 材料和細(xì)胞培養(yǎng)

人CRC細(xì)胞系（SW480、HCT-116細(xì)胞）和人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞（NCM460）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海）。10%胎牛血清（TBD公司），DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司），CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）;AGAP2-AS1的si-RNA慢病毒（si-AGAP2-AS1）、對(duì)照（si-NC）、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green預(yù)混液（TaKaRa公司，日本），CCK8試劑盒（Dojindo公司，日本）。

細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司）中，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中，間隔2 d更換培養(yǎng)基1次。

1.3 定量實(shí)時(shí)PCR

根據(jù)說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)步驟，使用Trizol試劑（Invitrogen）提取總RNA。首先，使用SuperScript IV逆轉(zhuǎn)錄酶（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA后，在Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（ABI，美國(guó)）上使用PrimeScript RT Master Mix（Takara，大連）進(jìn)行PCR 測(cè)定。所有反應(yīng)一式三份進(jìn)行，并選擇2-△△Ct方法用于分析AFAP1-AS1相對(duì)表達(dá)水平。18S rRNA分別用作mRNA的內(nèi)部參考。用2-△△Ct法分析相對(duì)表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。引物序列為對(duì)AGAP2-AS1，5'-TACCTTGACCTTGCTGCTCTC-3'（正向）和5'-TGTCCCTTAATGACCCCATCC-3'（反向）;18S rRNA，5'-CTTAATTTGACTCAACACGGGA-3'（正向）和5'-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGT-3'（反向）。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

依據(jù)操作手冊(cè)，從GenePharma（上海）購(gòu)買特異性靶向AGAP2-AS1（si-AGAP2-AS1）和陰性對(duì)照siRNA（si-NC），使用Lipofectamine 3000 Reagents（Invitrogen）將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中[6]。

1.5 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞增殖能力

通過(guò)CCK-8試劑盒評(píng)估不同組的細(xì)胞增殖率。將特異性靶向AGAP2-AS1（si-AGAP2-AS1）和陰性對(duì)照siRNA（si-NC）兩組細(xì)胞（密度每孔1×104個(gè)細(xì)胞）接種到96孔板中，各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，重懸于完全培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度至10個(gè)/μL后，繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h，分別加入10%CCK-8溶液。然后，將10 μL CCK-8溶液加入每個(gè)孔中，并將細(xì)胞在37℃、5%CO2下再保持1～2 h。最后，使用分光光度計(jì)測(cè)量450 nm處的吸光度，以代表細(xì)胞增殖能力，連續(xù)測(cè)量5 d[7]。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)量細(xì)胞凋亡。將用si-AGAP2-AS1和si-NC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別放入6孔板中，加入不含血清的RPMI培養(yǎng)基饑餓24 h后重新加入完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。隨后，使用PBS洗滌并重懸細(xì)胞。然后，使用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI在室溫下（避光）染色細(xì)胞15 min。用流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞群[8]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中AGAP2-AS1在CRC組織中的表達(dá)情況及小干擾序列在CRC細(xì)胞系中的干擾效率

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得356例結(jié)直腸癌，145例健康樣本，其中CRC組織中AGAP2-AS表達(dá)水平為（3.177±0.185），而正常組織中表達(dá)水平為（1.003±0.088）。其表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。通過(guò)siRNA成功抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中AGAP2-AS1表達(dá)，通過(guò) qRT PCR 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了siRNA的細(xì)胞AGAP2-AS1表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染siRNA的si-NC組，表達(dá)量下調(diào)近50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2），可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 干擾AGAP2-AS表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡

然后通過(guò)CCK8檢測(cè)CRC組及si-NC組的吸光度，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后，si-NC組吸光度值分別為（0.5007±0.0035）、（1.0356±0.0097）、（1.3273±0.0081）、（1.6953±0.0073）;si-AGAP2-AS1組吸光度值分別為（0.4523±0.0031）、（0.8526±0.0065）、（1.0402±0.0086）、（1.1663±0.0202）;兩組吸光度值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AGAP2-AS1干擾組吸光度明顯減低（P<0.05）（圖3）;且隨著時(shí)間的推移，干擾組和對(duì)照組的吸光度差異逐漸增大（圖3）;同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞凋亡數(shù)量由（181±14）升至（369±15），其凋亡顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖4。

3 討論

結(jié)腸癌發(fā)病率僅次于肺癌及肝癌，在全世界非常常見(jiàn)，目前全球每年新增確診結(jié)腸癌例數(shù)在120萬(wàn)左右，然而由于國(guó)內(nèi)人們體檢意識(shí)不強(qiáng)，且結(jié)腸癌早期無(wú)明顯特異性臨床表現(xiàn)，僅表現(xiàn)為排便習(xí)慣改變，故很多患者在被確診為結(jié)腸癌時(shí)已經(jīng)處于晚期。因此尋找關(guān)鍵的特異性生物標(biāo)志物對(duì)于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后至關(guān)重要[9-11]。

[7] Li W，Sun M，Zang C，et al. Upregulated long non-coding RNA AGAP2-AS1 represses LATS2 and KLF2 expression through interacting with EZH2 and LSD1 in non-small-cell lung cancer cells[J]. Cell Death & Disease，2016， 7：e2225-e2228.

[8] Wang H，F(xiàn)ang L，Jiang J，et al. The cisplatin-induced lncRNA PANDAR dictates the chemoresistance of ovarian cancer via regulating SFRS2-mediated p53 phosphorylation[J]. Cell Death & Disease，2018，9（11）：1103-1108.

[9] Zanconato F，Cordenonsi M，Piccolo S. YAP and TAZ：A signalling hub of the tumour microenvironment[J]. Nature reviews Cancer，2019，64（17）：113-117.

[10] Grelet S，Link LA，Howley B，et al. A regulated PNUTS mRNA to lncRNA splice switch mediates EMT and tumour progression[J]. Nature Cell Biology，2017，19（9）：1105-1115.

[11] Li C，Liu T，Zhang Y，et al. LncRNA-ZDHHC8P1 promotes the progression and metastasis of colorectal cancer by targeting miR-34a[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2019，23（4）：1476-1486.

[12] Kita Y，Yonemori K，Osako Y，et al. Noncoding RNA and colorectal cancer：Its epigenetic role[J]. Journal of Human Genetics，2017，62（1）：41-47.

[13] Wang YQ，Jiang DM，Hu SS，et al. SATB2-AS1 suppresses colorectal carcinoma aggressiveness by inhibiting SATB2-dependent snail transcription and epithelial-mesenchymal transition[J]. Cancer Research，2019，63（15）：1141-1147.

[14] 卞承玲，戴劍，陸亞云，等. 基于癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)直腸癌競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析[J]. 海軍醫(yī)學(xué)雜志，2018，39（4）：330-335.

[15] Van Cutsem E，Khayat D，Verslype C，et al. Phase Ⅰ dose-escalation study of intravenous aflibercept administered in combination with irinotecan，5-fluorouracil and leucovorin in patients with advanced solid tumours[J]. Eur J Cancer，2013，49（1）：17-24.

[16] Fan KJ，Liu Y，Yang B，et al. Prognostic and diagnostic significance of long non-coding RNA AGAP2-AS1 levels in patients with non-small cell lung cancer[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2017，21（10）：2392-2396.

[17] Tournigand C，André T，Achille E，et al. FOLFIRI followed by FOLFOX6 or the reverse sequence in advanced colorectal cancer：A randomized GERCOR study[J]. Clin Oncol，2004，22（2）：229-237.

[18] Luo W，Li X，Song Z，et al. Long non-coding RNA AGAP2-AS1 exerts oncogenic properties in glioblastoma by epigenetically silencing TFPI2 through EZH2 and LSD1[J]. Aging，2019，11（11）：3811-3823.

[19] Van Cutsem E，Tabernero J，Lakomy R，et al. Addition of aflibercept to fluorouracil，leucovorin，and irinotecan improves survival in a phase Ⅲ randomized trial in patients with metastatic colorectal cancer previously treated with an oxaliplatin-based regimen[J]. Clin Oncol，2012， 30（28）：3499-3506.

[20] Zhang M，Zhao Y，Zhang Y，et al. LncRNA UCA1 promotes migration and invasion in pancreatic cancer cells via the Hippo pathway[J]. Biochimica Et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease，2018，1864（5 Pt A）：1770-1782.

[21] Shrikhande SV. FDA approves regorafenib（Stivarga） for GIST[J]. Oncology，2013，27（3）：164-166.

（收稿日期：2019-11-14）