HPLC法測(cè)定乳粉及乳制品中酪蛋白磷酸肽含量

曾鳳澤*，姚宇澤

1. 烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校（烏蘭察布 012000）；2. 烏蘭察布市獸藥監(jiān)察所（烏蘭察布 012000）

酪蛋白磷酸肽（CPP），又名促鈣吸收因子，是以牛乳或酪蛋白制品為原料，用蛋白酶水解、精制、純化而生產(chǎn)制得的，含有1～6個(gè)磷酸絲氨酸殘基的生物活性肽[1-3]，具有促進(jìn)鈣、鐵、鋅等礦物元素吸收、預(yù)防齲齒、提高免疫力、促使惡性細(xì)胞凋亡等作用[4-6]，已被國(guó)家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 14880允許CPP用于調(diào)制乳、風(fēng)味發(fā)酵乳、糧食和糧食制品、飲料等，使用量≤1.6 g/kg。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于CPP的檢測(cè)方法主要有鋇-乙醇沉淀法[7-8]、等電聚焦電泳（IEF）法[9-10]、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法[11]、高效液相色譜（HPLC）法[12-16]，這些方法均有局限性，其中鋇-乙醇沉淀法專屬性較差，不可用于直接測(cè)定食品中CPP含量；IEF操作要求高、兩性電解質(zhì)較貴；LC-MS設(shè)備昂貴，檢測(cè)成本高，且CPP無(wú)固定分子量，質(zhì)譜對(duì)其監(jiān)測(cè)難度大；HPLC具有操作方便、檢測(cè)成本低、靈敏度高等特點(diǎn)，被用于CPP產(chǎn)品的含量測(cè)定，而關(guān)于乳及乳制品中CPP含量的測(cè)定較少。試驗(yàn)采用等電點(diǎn)沉淀蛋白，固相萃取柱MCX凈化，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相，經(jīng)ZORBAX SB-C18色譜柱梯度洗脫，采用二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定，建立HPLC法測(cè)定乳粉及乳制品中CPP含量，為食品中CPP的含量測(cè)定提供簡(jiǎn)便、高效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測(cè)器（DAD）（美國(guó)Agilent公司）；ME204E型電子分析天平（梅特勒托利多公司）；KQ-250B超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Vortex-genie2型渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；TTLDC氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；PHS-3G型pH酸度計(jì)（梅特勒托利多公司）；固相萃取柱MCX（60 mg/3 mL，美國(guó)Waters公司）；Milli-Q型超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

酪蛋白磷酸肽（純度98%，廣州綠翠生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）；氨水、鹽酸、乙酸（均為分析純）；超純水。

CPP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 mg/L）：準(zhǔn)確稱取250 mg（精度至0.1 mg）CPP（經(jīng)折算后的標(biāo)準(zhǔn)品），用超純水溶解并定容至250 mL棕色容量瓶中，4 ℃貯存。

1.2 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A乙腈，流動(dòng)相B 0.1%乙酸溶液，梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

準(zhǔn)確稱取2.0 g（精度至0.1 mg）粉碎均勻的樣品置于100 mL燒杯中，加入20 mL超純水（40～50 ℃）溶解，超聲10 min，用1.0 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液酸度pH 4.5±0.1，定容于50 mL容量瓶中，混勻后待凈化。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.2 凈化

固相萃取柱MCX依次用3 mL甲醇和3 mL超純水活化后，取10 mL待凈化液過(guò)柱（控制流速1滴/3～4 s），依次用超純水和甲醇各3 mL淋洗，用5 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮吹濃縮近干，用1 mL超純水溶解殘?jiān)^(guò)0.45 μm微孔濾膜，濾液供HPLC分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別準(zhǔn)確吸取適量CPP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 mg/L），用超純水定容依次配制質(zhì)量濃度5.0，10.0，50.0，100.0和200.0 μg/mL CPP標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用高效液相色譜儀測(cè)定，以CPP質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為使被測(cè)CPP波峰明顯，有較好的靈敏度，對(duì)CPP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在190～400 nm進(jìn)行紫外吸收峰掃描，結(jié)果顯示：CPP在220 nm和280 nm均有較強(qiáng)吸收，但選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，容易受到乳粉及乳制品或流動(dòng)相等基質(zhì)的干擾；選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，CPP色譜峰峰型對(duì)稱、峰面積較高、保留時(shí)間適中，且可有效提高乳粉及乳制品等復(fù)雜基質(zhì)樣品中共提取干擾物與CPP在色譜柱中分離度和檢測(cè)特異性。因此選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜柱的選擇

以色譜柱中CPP的峰面積、保留時(shí)間、分離度為評(píng)估指標(biāo)，考察Zorbax SB C18、Agilent Eclipse C18、Diamonsil C18、Shim-pack VP ODS C18、Acclaim 120 C18等色譜柱對(duì)乳粉及乳制品中CPP的分離效果（表2）。結(jié)果顯示，在相同條件下采用ZORBAX SB-C18色譜柱時(shí)，CPP色譜峰峰型對(duì)稱、保留時(shí)間適中，CPP可與雜質(zhì)干擾峰有效分離，且雜質(zhì)干擾峰較少，可有效提高乳粉類基質(zhì)復(fù)雜樣品中共提取干擾物與CPP在C18柱中的分離度，提高CPP檢測(cè)準(zhǔn)確性。因此選擇ZORBAX SB-C18作為分析柱。

2.3 流動(dòng)相的選擇

為了達(dá)到CPP與雜峰分離的目的，縮短分析時(shí)間，分析甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-乙酸銨、甲醇/乙腈-乙酸、甲醇/乙腈-十二烷基硫酸鈉等流動(dòng)相對(duì)乳粉及乳制品中CPP的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，CPP可與雜質(zhì)干擾峰有效分離，且目標(biāo)峰峰型尖銳對(duì)稱；從圖1～圖3中可知，CPP目標(biāo)峰與樣品中雜峰分離度較大。因此選擇乙腈-0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相。

表2 不同色譜柱對(duì)CPP的分離效果

圖1 CPP標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖

圖2 實(shí)際樣品的液相色譜圖

圖3 加標(biāo)樣品的液相色譜圖

2.4 蛋白沉淀劑的選擇

乳粉基質(zhì)相對(duì)比較復(fù)雜，尤其是蛋白質(zhì)含量較高，需將蛋白質(zhì)去除以降低干擾組分。通過(guò)采用1.0 mol/L鹽酸溶液、0.1%乙酸水和10 g/L三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)pH，考察等電點(diǎn)沉淀蛋白方式對(duì)乳粉及乳制品中CPP的凈化提取效果。結(jié)果表明，通過(guò)0.1%乙酸和10 g/L三氯乙酸調(diào)節(jié)溶液pH方式獲得的雜峰比1.0 mol/L鹽酸多，且雜峰會(huì)干擾CPP目標(biāo)峰。因此選擇1.0 mol/L鹽酸作為蛋白沉淀劑。

2.5 固相萃取柱的選擇

由于乳粉及乳制品中含有豐富的蛋白、脂肪和磷脂（包括卵磷脂、腦磷脂和神經(jīng)磷脂），為減少樣品基質(zhì)對(duì)色譜柱的污染，延長(zhǎng)色譜柱壽命，分析C18、C8、MCX、SCX、HLB、WCX等不同填料固相萃取柱對(duì)乳粉及乳制品中CPP的凈化回收率效果（圖4）。結(jié)果表明，HLB、C18和C8柱凈化效率和靈敏度較高，但易洗脫出較多雜質(zhì)干擾峰，降低檢測(cè)特異性；SCX柱凈化回收效率低，凈化效果不甚理想；MCX和WCX柱對(duì)CPP的保留能力較強(qiáng)，凈化回收率較高，尤其是MCX柱的凈化回收率高達(dá)98.6%，且洗脫后雜質(zhì)峰較少，凈化效果更佳。因此選擇MCX作為固相萃取柱。

圖4 不同固相萃取柱對(duì)CPP凈化回收率的影響

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

按建立的HPLC法，對(duì)CPP標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，以CPP質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。結(jié)果表明，CPP在5.0～200.0 μg/mL范圍內(nèi)，CPP質(zhì)量濃度與其峰面積之間具有良好線性關(guān)系，其回歸方程為y=421.3x-318.2，相關(guān)系數(shù)（r）=0.999 7。對(duì)添加低濃度CPP標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白試樣進(jìn)行HPLC測(cè)定，以3倍信噪比和10倍信噪比分別為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果表明，稱樣量2 g時(shí)，乳粉及乳制品中CPP的LOD和LOQ分別為1.5和5.0 mg/kg。

2.7 回收率與精密度

選擇具有代表性的牛奶粉、羊奶粉、奶鈣片及液體奶4種樣品，每種樣品中分別加入質(zhì)量濃度5.0，100.0和200.0 mg/kg的CPP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按試驗(yàn)建立的HPLC法重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。從表3可知，CPP在5.0～200.0 mg/kg加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率在86.9%～98.4%之間，RSD為1.2%～5.6%，表明方法準(zhǔn)確度高、精密度好。

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

采集國(guó)內(nèi)市場(chǎng)銷售乳粉及乳制品，各15份，按建立的HPLC法測(cè)定實(shí)際樣品中CPP含量。結(jié)果顯示，15份乳粉均檢出含有CPP成分，含量在21.4～126.3 mg/kg之間，若以CPP含量作為評(píng)價(jià)乳粉質(zhì)量指標(biāo)，該批乳粉質(zhì)量較高，可促進(jìn)人體對(duì)鈣、鐵、鋅等礦物元素吸收，具有預(yù)防齲齒、提高免疫力等功效；15份乳制品中，7份乳制品中未檢出CPP成分，這可能是由于乳制品在生產(chǎn)加工過(guò)程中添加的原料乳粉含量較少或未添加乳粉，從而引起乳制品中未檢出CPP含量。因此，為保障消費(fèi)者合法權(quán)益，應(yīng)加強(qiáng)乳粉及乳制品中CPP含量的檢驗(yàn)檢測(cè)。

表3 回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用等電點(diǎn)沉淀蛋白，MCX固相萃取柱凈化，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相，經(jīng)ZORBAX SBC18色譜柱梯度洗脫，二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定，建立高效液相色譜測(cè)定乳粉及乳制品中CPP含量的檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，在5.0～200.0 μg/mL范圍內(nèi)，CPP質(zhì)量濃度與其峰面積之間具有良好線性關(guān)系，r=0.999 7；LOD為1.5 mg/kg，LOQ為5.0 mg/kg；加標(biāo)回收率在86.9%～98.4%之間，RSD為1.2%～5.6%。方法具有準(zhǔn)確度高、精密度好、檢出限低、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可為乳粉及乳制品中CPP含量的測(cè)定提供測(cè)定方法。