基于p38MAPK通路的電針揚刺對大鼠創面修復及血清炎性因子表達的影響

杜偉斌 陳榮良 胡華輝 沈福祥 曹國平 王利祥 全仁夫

【摘要】 目的：探討基于p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路下的電針揚刺法對大鼠創面修復及血清相關炎性因子表達的影響。方法：選擇健康SD大鼠30只，將其按隨機數字表法分為模型組、電針組和電針+抑制組，每組10只。模型組制備全層皮膚缺損SD大鼠模型后每天只給予碘伏消毒包扎。電針組給予模型處理后，當日即開始電針揚刺治療，其后1次/d，共14次。電針+抑制組在每次電針揚刺治療前10 min，腹腔注射SB203580 5 mg/kg。術后觀察三組大鼠的一般行為，比較術后3、7、14 d三組創面面積愈合情況和術后3、7 d的血清相關炎性因子表達情況。結果：術后7、14 d，三組的創面面積和愈合率均優于術后3 d，差異均有統計學意義（P<0.05）;術后7、14 d，電針組的創面面積及愈合率均優于模型組、電針+抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05）。術后7 d，三組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于術后3 d，差異均有統計學意義（P<0.05）;術后3、7 d，電針組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）;且電針+抑制組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型組和電針組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：電針揚刺可抑制p38MAPK通路過度活化，降低大鼠血清中促炎因子過度表達，具有一定抗感染作用，并可加速創面修復。

【關鍵詞】 電針揚刺 創面修復 炎性因子 皮膚缺損

[Abstract] Objective： To investigate the effects of electroacupuncture on wound repair and expression of serum-related inflammatory factors in rats based on p38 mitogen-activated protein kinase （p38MAPK） pathway. Method： A total of 30 healthy SD rats were selected and divided into model group， electroacupuncture group and electroacupuncture + inhibition group according to random number table method， 10 rats in each group. In the model group， SD rats with full-thickness skin defect were treated with iodopor disinfection bandage every day. After the model treatment， the electroacupuncture group started the electroacupuncture needling treatment on the same day， followed by 1 time/d for 14 times in total. In the electroacupuncture + inhibition group， SB203580 5 mg/kg was intraperitoneally injected 10 min before each electroacupuncture needling treatment. The general behaviors of the three groups of rats were observed after surgery， and the wound area healing status of the three groups 3， 7 and 14 d after surgery and the expression of serum related inflammatory factors 3 and 7 d after surgery. Result： The wound area and healing rate of the three groups were better than that of the three groups at 7 and 14 d?after surgery， the differences were statistically significant （P<0.05）; 7 and 14 d after surgery， the wound area and healing rate of the electroacupuncture group were better than those of the model group and the electroacupuncture + inhibition group， with statistically significant differences （P<0.05）. 7 d after operation， the serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 of the three groups were all lower than those of the three groups， the differences were statistically significant （P<0.05）; 3 and 7 d after surgery， the serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the electroacupuncture group were lower than those in the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）; in addition， the serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the electroacupuncture + inhibition group were lower than those in the model group and the electroacupuncture group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Electroacupuncture quintuple puncture can inhibit the over-activation of p38MAPK pathway， reduce the over-expression of pro-inflammatory factors in rat serum， have certain anti-inflammatory effect， and accelerate wound repair.

[Key words] Electroacupuncture quintuple puncture Wound repair Inflammatory factor Skin defect

First-authors address： Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang University of Chinese Medicine， Hangzhou 311201， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.007

皮膚作為人體與外界環境之間的第一道屏障，是免疫系統的重要組成部分[1]。臨床上各種原因（如創傷、燒傷、切割傷等）引起的皮膚缺損越來越多，而其導致的皮膚面積缺損難愈，是目前臨床治療上的難點之一[2-3]。皮膚組織的自我更新及修復可概括為炎性反應、細胞增殖分化和組織重塑三個階段[4-5]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinases，MAPK）是一組細胞內廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是信號從細胞表面傳遞到細胞核內的重要傳遞者，而p38MAPK是MAPK信號轉導的通路之一。電針刺激是一種可調動皮膚內源性電流、糾正創面內環境、加速創面修復的綠色療法，但其內在作用機制尚不明確[6-7]。本實驗基于p38MAPK通路，以電針揚刺為主要手段，觀察干預后皮膚缺損大鼠創面面積及血清相關炎性因子表達的變化，從炎性反應階段探討基于p38MAPK通路下的電針刺激對創面修復的影響及可能的作用機制，為中醫特色治療臨床皮膚缺損疾病提供有效的實驗依據，開辟新的思路及方法?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑儀器 本實驗研究時間為2018年9月-2019年5月，清潔級SD大鼠30只，雌雄各半，體重（220±20）g，購自浙江中醫藥大學實驗動物中心，SPF級分籠飼養，溫度20～24 ℃，濕度50%～70%，適應性飼養1周后進行實驗，本實驗經過動物倫理委員會批準同意。TNF-α、IL-1β、IL-6試劑盒（assay公司，美國）、SB203580抑制劑（selleck公司，美國）、TaKaRa試劑盒、Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）、酶標儀（Thermo Scientific Varioskan Flash）。

1.2 全層皮膚缺損模型建立 結合前期造模基礎，制備全層皮膚切除創面大鼠模型。大鼠常規飼養1周，造模前12 h禁食水，麻醉后常規五點固定，造模區（左側：脊椎左側旁2 cm;右側：脊椎右側旁2 cm，選一側）剪毛、脫毛處理，生理鹽水沖洗，碘伏消毒，乙醇脫碘。利用打孔器將造模區中心皮膚進行全層切除，直徑約1.5 cm，深至皮下，制造皮膚全層切除傷模型。分置清潔籠內單籠正常喂養，保持傷口干燥、防止傷口感染。

1.3 大鼠分組及處理 將30只健康SD大鼠，按隨機數字表法分為模型組、電針組和電針+抑制組，每組10只。模型組制備全層皮膚缺損SD大鼠模型后每天只給予碘伏消毒包扎。電針組給予模型處理后，當日即開始電針揚刺治療（選取創面中心一點和創面邊緣正常皮膚0.5 cm處上下左右各一點，給予毫針（0.20 mm×13 mm）針刺，不施針刺手法，然后連接韓氏治療儀進行治療，負極位于中心，正極位于上下左右，頻率2 Hz，輸出電流0.6～1 mA，以毫針出現輕顫為度，1次/d，28 min/次）。電針+抑制組在每次電針揚刺治療前10 min，腹腔注射抑制劑SB203580，劑量為5 mg/kg。各組每天均用碘伏消毒包扎，預防創口感染，喂飼標準飼料。

1.4 觀察指標與評價標準 （1）一般行為學觀察：實驗開始后每天觀察大鼠的精神狀況、反應能力、攝食量、攝水量以及存活數等。（2）創面面積變化的測定：用游標卡尺測量并計算各組術后3、7、14 d創面面積和愈合率。創面面積愈合率=（治療前創面面積-治療后創面面積）/治療前創面面積×100%。（3）ELISA檢測：按照大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯免疫檢測試劑盒使用說明書進行操作，將標準品梯度稀釋;加入樣品、標準品、生物素標記二抗和酶標試劑，37 ℃反應1 h;洗板5次，加入顯色液A、B，37 ℃避光顯色10 min;加入終止液終止反應;上酶標儀讀取吸光度（OD值）。根據標準液的檢測結果得出標準曲線，求出各組樣品的實際濃度。

1.5 統計學處理 所有數據采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料用（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用F檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組SD大鼠一般資料比較 三組SD大鼠雌雄數、體重比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 三組一般行為學觀察結果 大鼠在術后首日可能因麻醉、驚嚇等原因普遍精神較差，術后第2天各組大鼠攝食量、攝水量均不同程度好轉并都基本恢復至正常水平，無死亡。

2.3 三組創面修復情況比較 術后3 d，三組大鼠創面面積和愈合率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;術后7、14 d，三組的創面面積和愈合率均優于術后3 d，差異均有統計學意義（P<0.05）;術后7、14 d，電針組的創面面積及愈合率均優于模型組、電針+抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 三組血清相關炎性因子表達情況比較 術后7 d，三組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于術后3 d，差異均有統計學意義（P<0.05）;術后3、7 d，電針組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）;且電針+抑制組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型組和電針組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

正常無損傷的皮膚往往維持一種“皮膚電池”作用。一旦皮膚受損，正常的經上皮電位會短路，電流從損傷上皮的底部流出，并在損傷處的邊緣形成穩定的電流，這種電流的負極指向受損皮膚表皮的深層部分，這便是損傷性內源性電場[8-9]。大部分慢性難愈性創面表面，內源性電場強度變弱。這使得外加微電流成為促進創面修復的一種可能的治療方案。在皮膚損傷后，創面組織和體內會形成大量炎癥反應，這些炎癥介質如未得到有效控制，可導致細菌的滋生繁衍，不利于創面修復[10-11]。因此，皮膚損傷后如何抑制過多的炎癥反應是加速創面修復的重要環節之一。Gürgen等[12]對大鼠皮膚創面進行2 Hz、15 min的電刺激后，在真皮、肉芽組織、毛囊、皮脂腺的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子得到了明顯抑制，證明了電刺激可抑制炎癥反應階段，縮短創面愈合時間。

杜偉斌等[13]總結得到MAPK信號轉導通路下的電針療法可產生多種效應，對多種臨床疾病具有較大的研究價值。在MAPK信號轉導通路家族中，p38MAPK、細胞外信號調節激酶（ERK-1/2）和c-jun末端激酶（JNK）3個途徑被最多研究。而p38MAPK信號通路能受到低氧、紫外線等因素刺激后發生磷酸化從細胞質轉移至細胞核內，并通過調節轉錄因子的活性及細胞因子的合成，對炎性反應的調控和創面愈合起著關鍵性的作用[14-15]。有研究表明，燒傷后p38MAPK明顯活化，并介導了炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的產生，在創面愈合中扮演著重要角色[16-17]。

皮膚創傷相當于中醫學的“潰瘍”“金瘍”“折瘍”。早在周代就有瘡瘍的詳細記載，并成立了獨立的?？啤Ｗ鳛樽鎳t學的瑰寶，中醫針灸在治療骨傷科、皮膚科疾病方面一直被認為是重要的治法之一。揚刺法源自《靈樞·官針》：“揚刺者，正內（納）一，傍內（納）四而浮之，以治寒氣之博大者也”。本法適用于病變范圍大、病變位置較淺的病癥，本法有舒筋活絡，消腫散結，益氣補血之功。電針刺激療法是在針刺基礎上外加電刺激，具有針刺及電刺激的雙重效益[18]。本課題組一直從事皮膚缺損創面修復的研究，電針揚刺是指揚針刺結合電針儀，在傳統針刺的基礎上，外加生物電的刺激，利用兩者協同作用，形成對創面的有效治療，是對祖國醫學中針灸學的一項重要革新和推進。

本研究基于p38MAPK通路，巧妙地運用揚刺法和電刺激的優勢，基于創面穩態電流概念，使皮膚損傷區損傷性內源性電場得到重建，發揮改善局部微循環功能，探討了對創面修復及血清相關炎性因子表達的影響。結果顯示：術后7、14 d，電針組愈合面積和愈合率均優于模型組和電針+抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05），提示p38MAPK信號通路是創面愈合的重要靶點，電針揚刺可有效加速創面修復的作用機制可能是抑制了p38MAPK信號通路的過度活化產生。術后3、7 d，電針+抑制組血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均低于模型組和電針組，差異均有統計學意義（P<0.05）。提示電針揚刺可抑制過度炎癥反應階段，且與一定程度的p38MAPK信號通路活化有關，這可能是縮短創面愈合時間作用機制之一。

綜上所述，本研究通過電針揚刺糾正損傷性內源性電場失衡現象，重建創面穩態電流回路發現，其可有效加速創面修復。其作用機制可能是抑制了p38MAPK信號通路過度活化，降低了血清或局部組織TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，抑制了創面愈合的多度炎癥反應階段，最終縮短了創面愈合時間。然而皮膚組織修復是一個復雜的過程，包含了炎癥反應、再上皮化、肉芽組織新生、早期血管化等一系列演變，這需要深入研究，發揮中醫藥的作用優勢，進一步多靶點研究其可靠的作用機制，并為臨床治療提供有效的實驗依據。

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（收稿日期：2020-03-04） （本文編輯：張爽）