溫和灸聯合間充質干細胞移植對大鼠損傷肛門括約肌功能的修復*

李 鵬 金文琪 李小嘉 丁旭楓 朱煜璋 楊 鏞 郭修田

（上海中醫藥大學附屬市中醫醫院，上海 200071）

大便失禁是指機體對液體、固體內容物以及氣體的蓄控能力的降低或喪失，不能隨意控制內容物的溢出，導致大便次數增多，輕者糞便污染內褲，重者完全排出。肛門括約肌損傷引起的結構和功能的破壞會導致大便失禁，它不僅給患者帶來極大的痛苦及心理障礙，還會嚴重影響患者的生活質量。大便失禁影響著5.9%的人口，隨著年齡的增加失禁的風險逐漸增大［1］。雖然目前對于大便失禁的治療方法多種多樣，包括飲食療法、口服藥物、膨脹劑注射、盆底神經刺激，生物反饋甚至手術治療等［2］，但是隨著時間的延長，復發率卻逐年增高，療效均不理想，使患者的身體及心理上的創傷也被放大，嚴重影響日常生活。

干細胞的多向分化潛能、歸巢機制、分泌生物活性因子等優勢使其在組織修復再生醫學中發揮著重要作用［3］。在一些動物及臨床研究中，細胞療法與生物工程技術作為一種無創的治療手段已應用于肛門括約肌組織的修復與再生［4］。但是許多研究也證實經靜脈注射的間充質干細胞出現在肺脾腎分布，大部分被清除，只有少部分可到達損傷部位。筆者前期研究證實溫和灸不僅可促進間充質干細胞的歸巢［5］，還可調節大鼠肛瘺術后創面組織局部血流、肉芽組織中血管內皮生長因子（VEGF）的表達從而促進組織修復［6］。因此，筆者將溫和灸與骨髓間充質干細胞（BMSC）移植聯合應用于大鼠損傷的肛門括約肌，觀察不同時間節點對損傷括約肌結構和功能的修復效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD雌性大鼠120只，年齡約12周，體質量200～250 g，SPF級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。大鼠BMSC制備方法：麻醉大鼠后，穿刺股骨骨髓腔抽取骨髓，DMEM-F12稀釋后接種在DF-12胎牛血清培養液中，并放入37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。每2～3天更換新鮮培養基。收集第三代消化后含有1×107的細胞懸液備用。

1.2 試藥與儀器［1］干細胞培養基及胎牛血清均選用Gibco公司的試劑（DMEM/F-12培養基，型號：12660-012；胎牛血清，型號：10091-148），鹽酸布比卡因選用山東華魯制藥有限公司，型號為H37022106，Masson染色試劑盒購于Baso公司（型號：BA4079A，BA4079B）。艾條選用佛山市艾傳醫療器械有限公司（李時珍蘄艾條，型號：1.8 cm×20 cm）。顯微鏡分別采用德國OLYMPUS解剖顯微鏡（型號：CX23）及激光共聚焦顯微鏡（型號：OLS5000），肛壓檢測采用成都儀器廠出產的多道信息采集處理系統（型號：RM6240BDJ型），大鼠球囊檢測裝置采用專利（專利號：ZL 2018 2 0913781.7）。

1.3 分組與造模 健康SD雌性大鼠120只隨機分為5組，每組24只，分別為空白對照組、溫和灸加干細胞組、干細胞組、溫和灸組與假手術組。各組大鼠肛門括約肌損傷均采用Zusthi模型，在腹腔麻醉后，于解剖顯微鏡下進行大鼠腹側縱行切除25%的肛門括約肌復合體，即切除10點位到2點位之間的括約肌復合體，術后采用壓迫止血及布比卡因（0.5 mg/kg）鎮痛。所有需采用干細胞及溫和灸治療的組別均采用以上方式治療，其中空白對照組大鼠不做任何治療；溫和灸加干細胞組大鼠在干細胞注射完成后立即進行溫和灸治療；干細胞組大鼠僅局部注射0.3 mL PBS(含107個BMSCs)；溫和灸組大鼠僅采用溫和灸局部治療15 min；假手術組僅造模，不做任何治療。

1.4 干預方法 干細胞注射：在大鼠括約肌損傷處及缺損兩側斷端邊緣直接注射，共0.3 mL PBS（含107個BMSCs），每個部位1/3細胞量。溫和灸治療：將點燃的蘄艾條放置距大鼠肛門約2 cm溫和灸大鼠肛門局部創面，治療15 min。所有治療均從造模后第1日開始，每日1次，連續7 d。空白對照組：不做任何治療。溫和灸加干細胞組：在大鼠括約肌損傷處基底部及兩側斷端各注射0.1 mL PBS（共0.3 mL PBS，含107個BMSCs），然后將點燃的艾條直對干細胞注射處（即括約肌損傷處）進行治療，時間15 min，每日1次，連續7 d。干細胞組：僅在大鼠括約肌損傷處基底部與兩側斷端各注射0.1 mL PBS（共0.3 mL PBS，含107個BMSCs），每日1次，連續7 d。溫和灸組：將點燃的艾條放置于距括約肌損傷處2 cm的部位進行局部治療，時間為15 min，每日1次，連續7 d。假手術組：僅造模，不做任何治療。

1.5 標本采集與檢測 1）大鼠肛門括約肌功能檢測：包括靜息壓、收縮壓與肌電振幅、頻率，均在造模后7、14、28 d進行測定。采用多道信息采集處理系統的不同檢測模塊，記錄并分析不同時間節點各組的功能指標。在大鼠腹腔注射麻醉后，將1個特制的球囊潤滑后完全放入大鼠肛內以進行括約肌壓力檢測，球囊插入深度為球囊淹沒后0.5 cm，球囊連接注射器與采集處理系統，每次注水0.8 mL擴張球囊以檢測肛壓。選取壓力通道，設置參數后每只大鼠檢測時間為波形穩定后15 min。保存所有文件，分別選取穩定波峰及基線值記錄為收縮壓與靜息壓。檢測肌電，將兩只30號US53153型同軸電針分別插在大鼠肛門3、9點位，深度約0.4 cm，電極夾連接采集系統，選取生物肌電模式進行檢測。設置參數后每只大鼠檢測時間為波形穩定后15 min。保存所有采集文件，為了定量肛門括約肌EMG動作電位的振幅和頻率，在每個節點的檢測波形中隨機選取5個5 s的時間間隔計算平均值，并設定一個高于噪音但低于動作電位的臨界值以定量動作電位的頻率。統計波形穿過此閾值的動作電位的振幅和頻率。2）組織形態學檢測：麻醉處死大鼠，解剖顯微鏡下剝離肛門括約肌（距離肛緣0.5～1 cm），制作為石蠟切片并進行Masson染色。染色完畢后采用共聚焦顯微鏡掃描全部組織。采用Image J進行肌肉及膠原纖維定量分析以比較各組的差異。

1.6 統計學處理 應用SPSS21進行統計分析，所有計量資料都進行正態性與方差齊性檢驗，實驗數據統一以（）表示。若資料滿足正態性、方差齊性與“球對稱”假設，采用重復測量資料的方差分析。采用one-way ANOVA聯合組間比較檢驗評價各組之間的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肛門括約肌壓力值比較 見表1。術后第7天，3組治療組的收縮壓均顯著高于假手術組，差異具有統計學意義（P＜0.05），但治療組組間無顯著差異。術后14 d，溫和灸加干細胞組的收縮壓顯著高于其他兩治療組，具有顯著差異（P＜0.05），但干細胞組與溫和灸組之間無顯著差異（P＞0.05）。術后28 d靜息壓均較術后14 d增高，且溫和灸加干細胞組仍顯著高于干細胞組、溫和灸組、假手術組3組（P＜0.05），但干細胞組、溫和灸組兩組間仍無顯著差異（P＞0.05）。在術后14 d時，干細胞組、溫和灸組、假手術組、溫和灸加干細胞組4組的靜息壓均較前增高，此時所有治療組肛管靜息壓均顯著高于假手術組，差異具有統計學意義（P＜0.05），但3組治療組組間仍無顯著差異（P＞0.05）。在術后28 d時，溫和灸+干細胞組的靜息壓雖顯著高于干細胞組與溫和灸組，但卻仍低于空白對照組。

表1 各組大鼠肛管收縮壓與靜息壓比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠肛管收縮壓與靜息壓比較（mmHg，±s）

與假手術組同期比較，*P＜0.05；與干細胞組、溫和灸組同期比較，#P＜0.05。下同

組別空白對照組（n=24）溫和灸加干細胞組（n=24）干細胞組（n=24）溫和灸組（n=24）假手術組（n=24）肛管靜息壓8.43±0.43 8.49±0.43 8.54±0.55 6.58±0.39 7.42±0.58*8.07±0.43*#6.21±0.89 7.08±0.32*7.57±0.62 6.26±0.84 7.03±0.83*7.53±0.49 6.17±0.57 6.32±0.36 6.96±0.67時間術后7 d術后14 d術后28 d術后7 d術后14 d術后28 d術后7 d術后14 d術后28 d術后7 d術后14 d術后28 d術后7 d術后14 d術后28 d肛管收縮壓12.40±0.79 12.30±0.64 12.30±0.70 7.98±0.63*9.69±0.46*#11.40±0.84*#7.89±0.69*8.79±0.27 10.30±0.77 7.95±0.62*8.71±0.44 10.60±0.86 7.19±0.48 8.28±0.39 9.65±0.44

2.2 各組大鼠肛門括約肌肌電指標比較 見表2。在術后14 d時，3組治療組的肌電振幅顯著假手術組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。在術后28 d時，溫和灸加干細胞組的振幅顯著高于干細胞及溫和灸組，差異具有統計學意義，但仍低于空白組，此時干細胞與溫和灸組仍無明顯差異（P＞0.05）。術后14 d，干細胞組、溫和灸組、假手術組3組的肌電頻率均顯著高于假手術組，并且溫和灸加干細胞組肌電頻率顯著高于干細胞組及溫和灸組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。并且這種差異一直持續到術后28 d。在術后28 d時，雖然溫和灸加干細胞組肌電頻率顯著高于其他治療組，但仍低于空白組，差異具有統計學意義。

表2 各組大鼠肛門括約肌肌電指標比較（±s）

表2 各組大鼠肛門括約肌肌電指標比較（±s）

組 別 時 間 肌電振幅 肌電頻率空白對照組（n=24）溫和灸加干細胞組（n=24）干細胞組（n=24）溫和灸組（n=24）假手術組（n=24）術后7 d術后14 d術后28 d術后7 d術后14 d術后28 d術后7 d術后14 d術后28 d術后7 d術后14 d術后28 d術后7 d術后14 d術后28 d 145±10.31 145±11.02 145±11.10 88.9±8.47 113±9.16*138±10.11*#88.4±5.27 110±6.01*132±10.9 88.7±6.98 111±6.34*129±9.81 87.4±6.53 103±8.75 120±6.11 40.9±3.01 41.2±3.25 41.5±2.93 17.3±4.68 27.8±0.86*#37.2±1.77*#17.5±3.01 23.8±1.47*31.9±3.57 17.8±2.83 23.6±2.12*32.3±0.67 17.3±1.33 20.2±1.41 26.5±0.60

2.3 各組大鼠肛門括約肌組織形態學檢測 見表3，圖1。在術后28 d時，Masson染色證實所有組別均仍有不同程度的環形缺損，但溫和灸加干細胞組已非常接近完整的環形，它的缺損面積明顯小于其他組別，缺損部位含有更多紅染的新生肌纖維，而C、D、E 3組缺損部位均顯示更多藍染的膠原纖維。定量分析肌肉面積百分比：溫和灸加干細胞組肌肉比例顯著高于其余3組，差異具有統計學意義，但仍低于空白組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠術后28 d肛門肌肉面積百分比（%）

圖1 各組造模后28 dMasson染色全景圖

3 討 論

組織的結構與功能相輔相成，結構的完整才能保證功能的正常行使，功能的正常依賴于完整的結構，肛門括約肌亦是如此。作為協調排便機制中的一種，肛門括約肌結構或功能的破壞會影響腸內容物的正常排出，而肛門括約肌的結構和功能則需要肌肉和神經的完整性，其中肛門括約肌損傷引起的大便失禁最為普遍。近年來，干細胞在組織修復與再生醫學方面的研究日新月異，因其多向分化潛能、旁分泌潛能、免疫調節與抑制潛能、便捷的分離與擴增等四大特性廣泛應用于各種組織工程學研究［7-9］。

骨髓間充質干細胞作為成體干細胞中的一種，在再生醫學領域受到廣泛重視［10-11］。雖然干細胞對大鼠損傷肛門括約肌的顯著的修復效果，但不同的研究結果差異較大。近年來許多研究證實移植的干細胞在創面的存活率與定植率并不能達到滿意的效果，而經靜脈注射的間充質干細胞出現在肺脾腎分布，大部分被清除，只有少部分可到達損傷部位，嚴重影響創面的修復作用。因此許多學者采用不同的方法以促進干細胞在創面的定植與存活率，包括與其他細胞共培養，生物材料或機械應力的使用等［12-17］。中醫學認為創面愈合的根本為正氣虛損，而溫和灸具有溫通氣血、扶正祛邪的功效，而且我們前期研究證實溫和灸不僅能夠促進骨髓間充質干細胞向損傷部位歸巢［5］，還可調節大鼠肛瘺術后創面組織局部血流、肉芽組織中VEGF的表達從而促進組織修復。

因此，基于溫和灸的溫通效應及歸巢機制，我們將溫和灸與骨髓間充質干細胞移植聯合應用于大鼠損傷的肛門括約肌，發現溫和灸聯合干細胞不僅可顯著促進大鼠肛門括約肌肛壓與肌電的恢復，還能促進肛門括約肌缺損部位肌肉新生及環形結構的恢復，從組織結構和功能兩方面研究證實溫和灸加干細胞移植顯著優于單純干細胞移植與溫和灸治療。但本研究也存在一些缺陷，由于觀察節點（28 d）的限制，所有治療組肛門括約肌組織均未恢復為正常的完整環形組織，雖然溫和灸+干細胞組大鼠的肛門括約肌趨于完整的環形組織，但仍有部分缺損，這可能也是導致治療組肛壓與肌電低于空白對照組的主要原因。但無論從功能性指標，抑或是組織形態學來分析，溫和灸與干細胞移植聯合應用的治療效果顯著高于其他治療組別。但是其中的機制是否與溫和灸促進干細胞的定植或分化，抑或與增強干細胞旁分泌效果有關仍未可知，未來仍需要更多更深入的實驗探索其相關機制。