復方蛹蟲草粉抗腫瘤活性的研究

甄亞欣 李愛民 趙明明 馮康 李子杰

摘要：本研究采用復方蛹蟲草粉水提取物，研究其對肺癌細胞A549、乳腺癌細胞MCF-7和慢性髓原白血病細胞K562的抑制作用。復方蛹蟲草粉水提取物對受試細胞處理24、48h后，采用CCK-8顯色法測定對腫瘤細胞的抑制率，并通過熒光顯微鏡觀察細胞的形態變化。結果表明，復方蛹蟲草粉水提取物對A549、MCF-7和K562細胞均有較強的抑制效果，處理48 h時效果最好，對A549、MCF-7、K562的抑制率分別達到了48.6%、13.4%和80.5%。細胞形態上表現為細胞膜均遭到破壞，內容物泄露。

關鍵詞：復方蛹蟲草粉；抗腫瘤；細胞增殖

引言

蛹蟲草又稱北冬蟲夏草，國家衛生健康委已經將蛹蟲草加入藥食兩用的中藥名單，具有很高的藥用價值。蛹蟲草中生物活性物質主要有蟲草素、蟲草多糖、蟲草多肽等，具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、免疫調節等生理活性，已經逐漸應用到保健、醫藥等領域。蟲草多糖能夠誘導T-淋巴細胞增殖，增強IL-2、IL-6的分泌，同時還可以增強巨噬細胞的吞噬作用。另有研究證實，蟲草素能夠抑制肺癌細胞A549和肺癌細胞H358的生長，且抑制作用呈劑量依賴性。

目前已有一些蟲草制品、富硒制品被證實具有抗腫瘤的功效，但其療效尚有待進一步提高。為了更好地開發利用蛹蟲草、松花粉、硒、裸藻等天然資源，本研究選用按照特定比例進行復配的復方蛹蟲草粉，將其水提取物分別作用于人肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF-7和人慢性髓原白血病細胞K562，研究其對如上三種腫瘤細胞生長的影響，并對其細胞形態進行觀察，為復方蛹蟲草粉類產品的資源開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF-7和人慢性髓原白血病細胞K562均購自南京科佰生物科技有限公司。復方蛹蟲草粉由國珍健康科技（北京）有限公司提供。DMEM無血清細胞培養基購自Gibco公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、100×青鏈霉素混合液均購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自Roche公司；DMSO購自Solarbio公司；CCK-8購自Donjindo公司；PBS（磷酸鹽緩沖液）購自BBI life science公司；二氧化碳培養箱購自Panasonic公司；倒置光學顯微鏡、熒光顯微鏡均購自日本尼康公司；臺式冷凍離心機購自HITACHI公司；Stat Fax-2100型酶聯免疫檢測儀購自BIO-RAD公司；T25細胞培養瓶購自Fisher公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋購自Thermo公司；YDS-20型液氮生物容器購自成都金鳳液氮容器有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2D型）購自NUAIRE公司。

1.2復方蛹蟲草粉水提取物的制備

稱取復方蛹蟲草粉0.5g，用50mL 60℃熱水浸提1.5h，重復兩次，合并提取液，0.45μm濾膜過濾，低溫濃縮至無水狀態，加入1mL去離子水復溶，真空干燥，稱重，配制提取物濃度為2mg/mL的溶液，再用0.22μm濾膜過濾。取1mL提取物，加入9mL培養液，得終濃度為200μg/mL。

1.3腫瘤細胞抑制實驗測定

選取對數生長期的A549、MCF-7和K562細胞，以1×105個/mL接種于96孔板中，每孔100μL。待細胞培養12h后，加入復方蛹蟲草粉水提取物，每孔100μL，每個樣品設置6個平行，對照組加入等體積含胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養箱中孵育24h、48h。培養結束后，小心吸出原培養液，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育1-4h后使用酶標儀測定450 nm波長下的吸光值。按如下公式計算提取物對細胞的抑制率：

抑制率（%）=（實驗組OD值-陰性組OD值）/（陰性組OD值-空白組OD值）×100%

1.4腫瘤細胞形態觀察

選取對數生長期的A549、MCF-7和K562細胞，以1×105個/mL接種于12孔板中，每孔1mL。待細胞培養12h后，加入復方蛹蟲草粉水提取物，每孔1mL，對照組加入等體積的培養液，置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養箱中孵育48h。培養結束后，小心吸出原培養液，用PBS輕輕的沖洗細胞2次后，加入一定體積的臺盼藍染色后熒光顯微鏡觀察。對于K562懸浮細胞，直接吸取一定體積的培養液，1000rpm，離心5分鐘，用PBS沖洗一次，離心后加入一定體積的培養基輕輕吹打混勻，加入等體積的臺盼藍進行染色，熒光顯微鏡觀察。

1.5數據分析

數據采用Spss 24.0進行統計分析。

2. 結果

2.1復方蛹蟲草粉水提取物對人肺癌細胞A549生長的影響

復方蛹蟲草粉水提取物處理A549細胞24、48h后，表現出一定的抑制效果。處理24h后，與對照組相比，復方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了A549細胞的增殖（P<0.01），抑制率達到22.3%。處理48h后，與對照組相比，復方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了A549細胞的增殖（P<0.01），抑制率達到了48.6%。

2.2復方蛹蟲草粉水提取物對人乳腺癌細胞MCF-7生長的影響

復方蛹蟲草粉水提取物處理MCF-7細胞24、48h后，表現出了一定的抑制效果。處理24h后，與對照組相比，復方蛹蟲草粉水提取物對MCF-7細胞的增殖無顯著影響（P>0.05）。處理48h后，與對照組相比，復方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了MCF-7細胞的增殖（P<0.01），抑制率達到13.4%。

2.3 復方蛹蟲草粉水提取物對慢性髓原白血病細胞K562生長的影響

復方蛹蟲草粉水提取物作用K562細胞24、48h后，表現出較強的抑制作用。處理24h后，復方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了K562細胞的增值（P<0.01），抑制率為66.0%。處理48 h后，復方蛹蟲草粉水提取物顯著抑制了K562細胞的增值（P<0.01），抑制率為80.5%。隨著處理時間的延長，抑制率不斷增加。

2.4復方蛹蟲草粉水提取物處理不同細胞后的形態觀察

復方蛹蟲草粉水提取物對A549細胞處理48h，染色后采用熒光顯微鏡進行觀察。對照組細胞完好無損，實驗組細胞間的間隔模糊不清，出現一些紅色的碎片即為細胞破碎后的殘體。

復方蛹蟲草粉水提取物對MCF-7細胞處理48h，染色后采用熒光顯微鏡進行觀察。對照組細胞大多數完好無損，實驗組細胞膜破裂，內容物流出。

復方蛹蟲草粉水提取物對K562細胞處理48h，染色后采用熒光顯微鏡進行觀察。對照組細胞結構完整無損，實驗組細胞膜破裂，且無法辨別出細胞膜的形態。

3 討論

從體外細胞實驗結果來看，在一定的濃度下，復方蛹蟲草粉水提取物對A549、MCF-7和K562細胞均有一定的抑制作用，最佳抑制率分別為48.6%、13.4%和80.5%。當作用時間為48h時，K562細胞對于復方蛹蟲草粉水提取物更加敏感。從熒光顯微鏡結果來看，復方蛹蟲草粉水提取物對A549的細胞膜損害作用較大，不僅能夠損害細胞膜，還能促進細胞膜裂解。復方蛹蟲草粉水提取物對MCF-7的細胞膜具有一定的損害作用，但是毒作用較低，只是造成細胞膜破裂，內容物流出。復方蛹蟲草粉水提取物對K562的細胞膜損害作用非常大，細胞膜幾乎完全裂解，促進了細胞的凋亡。細胞形態的結果與抑制率結果相一致。

通過比較復方蛹蟲草粉水提取物對A549、MCF-7和K562細胞的抑制情況，我們發現，雖然復方蛹蟲草粉水提取物能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，但對不同的腫瘤細胞其抑制效果并不相同，這表明復方蛹蟲草粉水提取物對腫瘤細胞的增殖抑制作用具有特異性，可能對某些特定的腫瘤細胞具有較好的療效。一方面可能是由于細胞形態結構不同所造成的；另一方面可能是三種癌細胞的細胞信號通路調控不同、干預不同階段的細胞周期所致。

另外，研究證實硒化蛹蟲草多糖的抗腫瘤活性與硒含量呈正相關，富硒蛹蟲草誘導NCI-H292細胞凋亡呈濃度依賴性，蛹蟲草多糖對HepG2肝癌細胞的抑制率與濃度和作用時長呈正相關。本研究中只選用了一種濃度處理細胞，因此，還需要進一步研究不同梯度的復方蛹蟲草粉水提取物對腫瘤細胞的抑制作用是否存在濃度依賴性，為復方蛹蟲草類產品的開發提供充分的理論依據。

作者簡介：

甄亞欣（1995-），女，漢族，河北石家莊人，碩士，研究方向：食品加工。