基于超高液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用技術篩選多囊卵巢綜合征患者卵泡液生物標志物

李天鶴，賈嬋維，劉瑞霞，陰赪宏

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院 北京婦幼保健院，北京 100026)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的內分泌性疾病，在世界范圍內廣泛流行，發病率大約為5%～10%[1]。其主要特征為：寡/無排卵、卵巢多囊樣改變、臨床/生化水平上的高雄激素。以2003年制定的鹿特丹診斷標準，按照不同表型可將PCOS分為 A、B、C、D四個類型[2]。多項研究發現，PCOS婦女發生生殖障礙、代謝異常、產科并發癥、心腦血管等疾病的概率要高于普通人群[3-4]。由于PCOS具有臨床異質性的特點，因此其發病機制還不明確。

代謝組是細胞、組織或生物體所有內源性小分子代謝物的集合。代謝組學是利用生物學手段，通過分析代謝產物，預測生物行為結果的學科，可從整體角度反映外界刺激或病理條件下細胞或組織代謝應答的變化[5]。因此，利用代謝組學有助于篩選疾病標志物，尋找相關代謝通路，從而更好的解釋疾病發病機制，進一步指導臨床治療[6]。相比于傳統高效液相色譜，超高效液相色譜技術具有分離快、效率高、通路高、靈敏度高等特點；四級桿飛行時間質譜則對代謝物的鑒別具有更高的準確性，兩者結合具有可發揮更大的優勢。基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用技術(UHPLC-QTOFMS)具有高通量、高分離能力、高靈敏度和專屬性等優勢，在檢測過程中可減少基質干擾，有利于復雜樣本的分離，可以更好的保證代謝產物的篩選[7]。

本研究采用UHPLC-QTOFMS方法檢測PCOS患者卵泡液中代謝組學數據，采用多元統計學方法篩選與PCOS相關的生物標注物，通過分析代謝通路變化，差異代謝物的相關性，初步明確影響PCOS卵巢功能相關因素，為臨床上PCOS的診斷和治療提供一定的理論依據。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年4～8月于首都醫科大學附屬北京婦產醫院就診患者為研究對象。健康對照組主要選自本中心行男方因素性ICSI患者(6例)，實驗組為本院行IVF/ICSI治療的PCOS患者(7例)。納入標準：(1)年齡25～35歲；(2)參照2003年PCOS“鹿特丹標準”，符合臨床診斷標準者。排除標準：(1)患者臨床表現與PCOS臨床和內分泌癥狀相似的非PCOS患者；(2)腫瘤患者，精神類疾病患者；(3)不符合納入標準，資料不全患者。

本研究通過首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準(2018-KY-050-01)。

二、實驗方法

1.樣本采集：取卵時刺穿主卵泡以提取卵泡液，并盡可能過濾血液，1 000 rpm離心10 min后分離上清，移入1.5 ml無菌離心管中，于-80℃冰箱保存備用。

2.代謝物提取：移取100 μl樣品，加入400 μl提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)，含同位素標記內標混合物]渦旋混勻30 s，冰水浴超聲5 min；-40℃ 靜置1 h；將樣品于4℃、12 000 rpm離心15 min，取上清400 μl于EP管中，真空干燥；加入200 μl 50%乙腈復溶，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min；將樣品于4℃、13 000 rpm離心15 min；取75 μl上清液于進樣瓶中上機檢測；所有樣品另取10 μl上清混合成質控(QC)樣品上機檢測。

3.上機檢測：使用ExionLC Infinity系列UHPLC系統(AB Sciex，美國)進行UHPLC分離，該系統配備UPLC BEH酰胺柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，水)，流動相為25 mmol/L醋酸銨和25 mmol/L氫氧化氨水(pH=9.75)(A)和乙腈(B)。洗脫梯度為：0～0.5 min，95% B；0.5～7.0 min，95%～65% B；7.0～8.0 min，65%～40% B；8.0～9.0 min，40% B；9.0～9.1 min，40%～95% B；9.1～12.0 min，95% B，柱溫25℃。自動進樣溫度為4℃，進樣體積分別為2 μl(pos)和2 μl(neg)。在LC/MS實驗中，使用三重式5600質譜儀(AB-Sciex，美國)在信息依賴的基礎上獲得MS/MS光譜。在這種模式下，采集軟件(Analyst TF 1.7，AB Sciex，美國)在收集和觸發MS/MS光譜采集時，根據預先選擇的標準持續評估全掃描測量MS數據。在每一個循環中，在30 ev的碰撞能量(CE)下，選擇強度>100的12個前體離子進行MS/MS分析。循環時間為0.56 s，設定ESI源條件為：氣體1為60 psi，氣體2為60 psi，幕氣為35 psi，源溫度為600℃，去團電位為60 v，離子噴涂電壓浮動(ISVF)為5 000 v或-4 000 v(圖1)。

圖1 數據分析流程圖

三、數據預處理和注釋

利用proteomwizard將MS原始數據(.wiff)文件轉換為mzXML格式，并用R包XCMS(3.2版)進行處理。該過程包括峰值反褶積、對準和積分。Minfrac和cut-off分別設置為0.5和0.3。內部MS2數據庫用于代謝物鑒定。

正離子模式的原始數據包含3個QC樣本和13個實驗樣本，從中提取1 848個Peak，對單個Peak進行過濾以去除噪音，只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數據。對數據進行標準化處理。利用每個樣本的總離子流進行歸一化。

四、統計分析

采用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法-判別分析法(PLS-DA)從整體上對樣本進行直觀、可靠和有統計學意義的分析。在得分圖中每個點代表一個對應的樣本，載荷圖中離散點代表得分圖分離的變量，離散度越高，對得分圖貢獻越大。通過t檢驗對每個變量進行計算求出P值，0.01

結 果

一、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)方法進行主成分分析

使用SIMAC軟件(V15.0.5，Sartorius Stedim Data Analysis AB，Umea，瑞典)對數據進行對數轉化加UV格式處理，進行OPLS-DA分析，過濾掉代謝物中與分類變量不相關的正交變量，得到更加可靠的代謝物的組間差異與實驗組的相關程度。各卵泡液樣本的OPLS-DA得分散點圖結果顯示，對照組和PCOS實驗組內分布均勻，組間代謝物分布具有差異性(圖2A)。為避免檢驗模型的過擬合以及評估模型的統計顯著性上有重要作用，進行了OPLS-DA置換檢驗，結果(圖2B)顯示，模型R2Y非常接近1，說明建立的模型符合樣本數據的真實情況，Q2接近0.5，該模型可以很好的解釋兩組樣本之間的差異。同時隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機模型的Q2逐漸下降，說明模型具有良好的穩定性，不存在過擬合現象。

A：利用LC-MS/MS篩選對照組及PCOS患者卵泡液中差異代謝物。將數據進行預處理和注釋后，進行多元變量模式識別分析。主成分分析(principal component analysis，PCA)顯示樣本全部處于95%CI。橫坐標表示第一主成分的預測主成分得分，縱坐標表示正交主成分得分，散點形狀和顏色表示不同實驗分組。B：兩組OPLS-DA模型的置換檢驗(Permutation test of OPLS-DA)。結果表明該模型具有良好的穩定性，不存在過擬合現象。橫坐標表示置換檢驗的置換保留度，縱坐標表示R2Y或Q2的取值，綠色圓點表示置換檢驗得到的R2Y值，藍色方點表示置換檢驗得到的Q2值，兩條虛線分別表示R2Y和Q2的回歸線(B)

二、PCOS患者卵泡液差異代謝物篩選

以Studentt檢驗方法計算得到P<0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(VIP)>1為標準進行差異代謝物篩選。將篩選得到的差異代謝物的結果以火山圖的形式進行可視化。結果顯示，在PCOS患者卵泡液中篩選得到了60個差異代謝產物。與對照相比，有20種代謝物在PCOS患者卵泡液中下調(P<0.05，VIP>1)，40種代謝物上調(P<0.05，VIP>1)(圖3)。

火山圖中每個點代表一個代謝物，橫坐標代表該組對比各物質的倍數變化，縱坐標表示利用學生t檢驗計算得出的P-value，散點大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點越大VIP值越大。散點顏色代表最終的篩選結果，顯著上調的代謝物以紅色表示，顯著下調的代謝物以藍色表示，非顯著差異的代謝物為灰色

三、PCOS患者卵泡液中差異代謝物的篩選和鑒定

通過以上分析得到的差異代謝物，在生物學上往往具有結果和功能相似性/互補性。對差異代謝物的定量值計算歐式距離矩陣，以完全連鎖方法對差異代謝物進行聚類分析，以熱力圖進行展示。結果顯示，與對照組相比，PCOS患者卵泡液中差異代謝物大致分為氨基酸、脂質、有機化合物、有機氧化合物等；60種差異代謝物中，24種物質為脂質類物質、9種物質為氨基酸類。與對照組相比，脂質類物質如PC(22∶4(7Z，10Z，13Z，16Z)/20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z))、PC(20∶4(8Z，11Z，14Z，17Z)/20∶4(8Z，11Z，14Z，17Z))、SM(d18∶1/12∶0)、2-Methylbutyroylcarnitine、5-HETE、1-O-Hexadecyl-2-O-dihomogammalinolenoylglycero-3-phosphocholine、Pivaloylcarnitine、Medroxyprogesterone、L-Octanoylcarnitine、Dolichosterone等升高；性激素相關代謝物如硫酸雄酮和睪酮水平在PCOS卵泡液中上調；而有機氧化合物如Benzyl O-[arabinofuranosyl-(1->6)-glucoside]、7-beta-D-Glucopyranosyloxybutylidenephthalide、表皮素水平在PCOS卵泡液中下調(圖4)。

橫坐標代表不同實驗分組，縱坐標代表該組對比的差異代謝物，不同位置的色塊代表對應位置代謝物的相對表達量

四、差異代謝物的代謝通路分析

為了進一步明確PCOS患者卵泡液中代謝物變化與代謝通路間的關系，通過對差異代謝物所在通路進行富集分析和拓撲分析，篩選得到與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。結果顯示，通過差異代謝物對KEGG、PubChem代謝物數據庫進行映射和代謝通路分析，發現PCOS患者卵泡液中嘧啶代謝和性激素合成通路發現變化，主要的差異代謝物為胞嘧啶和睪酮的變化(圖5)。

代謝通路分析的結果以氣泡圖進行展示。氣泡圖中每一個氣泡代表一個代謝通路，氣泡所在橫坐標和氣泡大小表示該通路在拓撲分析中的影響因子大小，氣泡越大表明影響因子越大；氣泡所在縱坐標和氣泡顏色表示富集分析的P值

五、差異代謝物的相關性分析

利用Pearson方法對差異代謝物的定量值進行相關系數分析。結果顯示，血清中睪酮與氨基酸[(2E)-Decenoyl-ACP、脯氨酸]、脂質[5-羥色胺、PS(22∶0/18∶4(6Z，9Z，12Z，15Z))、PC(P-18∶0/22∶4(7Z，10Z，13Z，16Z))、PC(15∶0/20∶2(11Z，14Z))、24-表油菜甾醇內酯、溶血磷脂類]、有機氧化合物表皮菌素間均具有顯著相關性(P<0.05)。此外，硫酸雄酮與脂質[3b-Hydroxy-6b-(2，3-epoxy-2-methylbutanoyloxy)-7(11)-eremophilen-12，8b-olide、SM(d18∶1/12∶0)、PC(18∶3(6Z，9Z，12Z)/18∶3(6Z，9Z，12Z))、1-O-Hexadecyl-2-O-dihomogammalinolenoylglycero-3-phosphocholine、Pivaloylcarnitine、PC(20∶1(11Z)/15∶0)]、有機雜環化合物[N-4-羥基肉桂酰亞胺、西藏龍膽堿]、有機氧化合物[表皮菌素、葡萄糖苷]間均具有顯著相關性(P<0.05)。

討 論

卵巢功能對于女性生殖健康具有重要作用，是卵母細胞發育、維持排卵的重要器官[8]。PCOS內部微環境的變化可以影響卵巢功能，特別是卵母細胞發育[9]。研究發現，游離脂肪酸(FFA)代謝紊亂可影響卵母細胞發育，導致卵母細胞生長和分化異常[10]。與健康對照相比，PCOS患者卵泡液中脂質代謝異常，其相關脂質產物如：PC(22∶4(7Z，10Z，13Z，16Z)/20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z))、PC(20∶4(8Z，11Z，14Z，17Z)/20∶4(8Z，11Z，14Z，17Z))、SM(d18∶1/12∶0)、2-Methylbutyroylcarnitine、5-羥色胺、1-O-Hexadecyl-2-O-dihomogammalinolenoylglycero-3-phosphocholine、Pivaloylcarnitine、Medroxyprogesterone、L-Octanoylcarnitine、Dolichosterone等的水平顯著升高。脂質代謝紊亂可進一步影響胰島素敏感性，從而間接影響卵母細胞分化[11]。此外，脂質代謝異常還可以促進氧化應激標志物積累[12]，上調炎癥因子[13]，從而進一步加劇PCOS。

PCOS患者卵泡液中游離脂肪素水平的增加與體內雄激素，特別是睪酮和硫酸雄酮密切相關。在PCOS患者血清中同樣得到證實[14]。卵泡液中睪酮水平與5-羥色胺、PS(22∶0/18∶4(6Z，9Z，12Z，15Z))、PC(P-18∶0/22∶4(7Z，10Z，13Z，16Z))、24-Epibrassinolide、LysoPI(18∶0/0∶0)呈正相關。雄激素可能通過調控脂質合成代謝[15]，靶向肌肉、脂肪、肝臟等組織[16]，影響胰島素敏感性[17]，造成胰島素抵抗。

PCOS患者卵泡液中脯氨酸水平增加，并且與睪酮水平呈正相關。血漿中長鏈氨基酸(BCAA)和芳香族氨基酸(AAA)與肥胖和胰島素抵抗密切相關[18]。環形甘氨酸-脯氨酸(cGP)可以通過調控胰島素樣生長因子(IGF)-1功能參與胰島素抵抗，此外，在體內和體外的研究發現，cGP/IGF-1比值可影響IGF-1的生物活性。外源添加高劑量脯氨酸可以導致小鼠胰島和INS-1E細胞中基礎胰島素分泌增加，葡萄糖刺激的胰島素分泌降低。此外，脯氨酸還可以損傷胰島素基因轉錄和線粒體氧化磷酸化[19]。表明雄激素可能通過調控氨基酸水平，影響胰島素抵抗，參與PCOS進程。

高雄激素血癥是PCOS的臨床診斷指標之一[20]，大多PCOS患者血清中睪酮水平高于正常人群。本研究發現，與對照組相比，PCOS患者卵泡液中睪酮和硫酸雄酮水平增加，表明PCOS患者伴隨卵巢局部微環境雄激素改變。卵巢組織是雄激素作用的重要靶組織。雄激素可以直接通過作用于卵巢組織影響卵母細胞發育，影響排卵，損傷卵巢功能。

采用Pearson方法對差異代謝物進行關聯分析，兩個變量之間的相關程度通過相關系數r來表示。橫縱坐標代表該組對比的差異代謝物，不同位置的色塊代表對應位置代謝物間的相關系數大小，紅色表示正相關，藍色表示負相關。X表示非顯著性相關

綜上所述，本研究建立了基于超高液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用技術篩選卵泡液中差異代謝物的方法。我們發現，PCOS患者卵泡液中氨基酸、脂肪酸、有機氧化和物等代謝物發生變化。且部分代謝物的改變與睪酮水平密切相關，表明改善PCOS患者部分脂肪酸和氨基酸的改變可能影響卵巢微環境，影響卵巢功能。