高級別漿液性卵巢癌中膜突蛋白的表達與意義

祝彩霞?楊娟?袁林靜?牛剛

【摘要】目的 檢測膜突蛋白（MSN）在進展型高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）中的表達情況，分析MSN表達上調對卵巢腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。方法 在124例進展型HGSOC標本中應用逆轉錄PCR檢測MSN mRNA的表達情況，分析其與臨床特征和預后的關系。體外培養卵巢腺癌細胞OVMZ-6，轉染過表達MSN后應用逆轉錄PCR和蛋白免疫印跡法驗證MSN表達變化;分別采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法、Transwell小室實驗和流式細胞儀檢測MSN表達上調后對卵巢腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。結果 進展型HGSOC標本均能檢出MSN mRNA的表達，Kaplan-Meier生存分析顯示MSN mRNA高表達者總生存期高于MSN mRNA低表達者（P < 0.05），但無進展生存期組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。多因素Cox回歸分析顯示MSN mRNA高表達是總生存期的獨立保護因素（HR = 0.51，95%CI 0.31 ～ 0.84，P = 0.009）。MSN-pRc/RSV轉染后，OVMZ-6細胞中MSN mRNA和蛋白表達水平顯著上調。MSN過表達的OVMZ-6細胞增殖能力和侵襲能力明顯下降（P均< 0.05）。結論 進展型HGSOC中MSN表達上調可抑制卵巢腺癌細胞的增殖和侵襲能力，影響患者總生存期，提示MSN可能是進展型HGSOC精準治療的新靶點。

【關鍵詞】高級別漿液性卵巢癌;膜突蛋白;細胞增殖;侵襲;預后

Expression and clinical relevance of moesin in high-grade serous ovarian cancer Zhu Caixia， Yang Juan， Yuan Linjing， Niu Gang. Department of Obstetrics and Gynecology， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China

Corresponding author， Niu Gang， E-mail： Niugang@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To detect the expression level of moesin （MSN） and clinical relevance in advanced high-grade serous ovarian cancer （HGSOC）， and to evaluate the effect of MSN overexpression on cell proliferation and invasiveness in ovarian cancer cell line OVMZ-6. Methods The expression level of MSN mRNA in 124 advanced HGSOC specimens was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）， and its correlation with clinical characteristics and prognosis was analyzed. After stable transfection with overexpressed MSN， the expression level of MSN mRNA and protein of ovarian cancer cell line OVMZ-6 were determined by RT-PCR and Western blot. The effect of MSN on cell proliferation and invasiveness was evaluated by MTT assay， Transwell chamber assay and flow cytometry in vitro. Results MSN mRNA could be detected in all HGSOC tissues. Kaplan-Meier survival analysis showed that elevated MSN mRNA expression predicted longer overall survival （OS） （P < 0.05）， whereas there was no significant association between MSN mRNA and progression-free survival （PFS） （P > 0.05）. Multivariate Coxs regression analysis demonstrated increased MSN mRNA expression was identified as an independent favorable prognostic factor for OS （HR = 0.51，95%CI 0.31 ～ 0.84，P = 0.009）. The expression levels of MSN mRNA and protein were significantly up-regulated after transfection with MSN-pRc/RSV. The cell proliferation and invasiveness were significantly inhibited in ovarian cancer cells transfected with MSN overexpression （all P < 0.05）. Conclusions Overexpression of MSN can suppress cell proliferation and invasiveness of ovarian cancer cells， resulting in longer OS in patients diagnosed with advanced HGSOC. MSN might serve as a novel therapeutic target in advanced HGSOC.

【Key words】High-grade serous ovarian cancer;Moesin;Cell proliferation;Invasiveness;Prognosis

上皮性卵巢癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌，病死率居首位。上皮性卵巢癌主要分為5類：高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）、低級別漿液性卵巢癌（LGSOC）、黏液性卵巢癌、透明細胞癌和內膜樣癌[1]。HGSOC是主要的上皮性卵巢癌類型，占上皮性卵巢癌死亡病例的70% ～ 80%[2]。由于臨床表現不典型和缺乏特異性的檢測手段，患者確診時多為進展型HGSOC（FIGO Ⅲ期或Ⅳ期），治療方式以手術和化學治療為主，但自20世紀80年代以來進展型HGSOC的5年總生存期無明顯改善，僅為15% ～ 25%[2]。膜突蛋白（MSN）是膜-細胞骨架蛋白（ERM）家族成員之一，主要連接肌動蛋白細胞骨架和細胞膜。ERM蛋白包括埃茲蛋白、根蛋白和MSN，是細胞結構維持和細胞活動的調節蛋白之一，參與各類生理和病理過程。有研究發現，ERM蛋白可誘導上皮細胞間質化和影響腫瘤細胞黏附性，參與腫瘤轉移，但另一個家族成員Merlin蛋白則抑制腫瘤發生發展[3]。有報道表明，卵巢癌中埃茲蛋白高表達可促進腫瘤細胞轉移，影響腫瘤復發和患者總生存期，但目前關于MSN在進展型HGSOC中作用的報道缺乏[4]。本研究檢測進展型HGSOC組織中MSN mRNA的表達情況，在卵巢腺癌細胞OVMZ-6中過表達MSN，體外實驗分別驗證MSN表達上調對OVMZ-6細胞的增殖和侵襲的影響，為進展型HGSOC的精準治療研究提供新的方向。

材料與方法

一、臨床標本和資料收集

選取2004年1月至2014年12月在我院行初次全面分期手術或腫瘤減滅術、術后病理診斷確診為HGSOC的124例患者，患者年齡為33 ～ 88歲、中位年齡62歲，臨床分期為FIGOⅢ期或Ⅳ期。所有病例術前均未進行化學治療，術中取新鮮腫瘤組織，凍存用于RNA提取，術后采用鉑類+紫杉醇（TC）方案化學治療。所有患者均隨訪5年，總生存期（OS）定義為從首次治療開始至死亡日或終檢值;無進展生存期（PFS）為首次治療至疾病出現進展或任何原因死亡的時間。所有患者均同意所采集的臨床標本及相關資料用于臨床研究，并簽署知情同意書，研究方案符合倫理學標準并取得醫院倫理委員會的批準（[2017]222號）。另于kmplot數據庫（http：//kmplot.com）收集進展型HGSOC MSN mRNA低表達與高表達患者的5年生存數據。

二、主要材料和試劑

卵巢腺癌細胞株OVMZ-6、OVCAR-3、CAOV -3由本單位實驗室保存。細胞培養相關試劑包括DMEM培養基、胎牛血清、脂質體（Life Technologies， 美國），嘌呤霉素（Thermofisher， 美國），All Prep DNA/RNA Universal kit （Qiagen， 德國），RNeasy Plus mini kit （Qiagen， 德國），Cloned AMV First-Strand Synthesis System kit （Invitrogen，美國），MSN和內參HPRT引物Hs00741306_mH和Hs02800695_m1（Thermofisher， 美國），MSN-pRc/RSV和p-Rc/RSV（上海吉瑪制藥技術有限公司）;四甲基偶氮唑藍（MTT， Sigma， 美國），Transwell小室（8 μm， Millipore， 美國），PVDF膜（Millipore， 美國）;相關蛋白MSN-Antibody（HPA0111335， Sigma， 美國）、GAPDH-Antibody（MAB374， Abcam， 美國）。

三、方 法

1. 細胞培養和轉染

卵巢腺癌細胞株OVMZ-6和CAOV-3培養于10%胎牛血清的DMEM培養基中，OVCAR-3細胞株培養于10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中。預實驗逆轉錄PCR檢測顯示OVCAR-3和CAOV-3細胞中MSN mRNA高表達，OVMZ-6細胞中MSN mRNA低表達，選取OVMZ-6細胞進行后續實驗。取對數生長期的OVMZ-6細胞，胰酶消化后接種至6孔板，每孔約2×105個細胞，培養24 h后應用脂質體轉染MSN-pRc/RSV及空載質粒pRc/RSV。培養6 h后更換新鮮DMEM培養基。隨后應用嘌呤霉素篩選穩定表達MSN的細胞（OV-MSN，包括克隆1、3、5）和對照組細胞（OV-VC）以及未經轉染的OVMZ-6細胞（OV-WT）繼續后續實驗。

2. 逆轉錄PCR

分別提取進展型HGSOC組織和各組卵巢腺癌細胞的總RNA，Nano drop測定RNA濃度及純度，逆轉錄試劑盒逆轉錄合成模板DNA，應用Taqman PCR反應體系對各樣本的MSN mRNA和內參HPRT進行定量PCR反應，反應條件：95℃ 3 min預變性，95℃ 15 s，60℃ 1 min延伸，

共40個循環。MSN和內參HPRT應用Hs007 41306_mH和Hs02800695_m1（Thermofisher， 美國）。引物序列如下：MSN正向引物5-AAGTTGCT CCCGCAGAGA-3，反向引物5-TGTTCCTCATG CCACACCT-3，HPRT正向引物5-TGACCTTGAT TATTTTGCATACC-3，反向引物5-CGAGCAAGA CGTTCAGTCCT-3，目的基因相對表達量采用2-??Ct法分析。

3. 蛋白免疫印跡法

收集過表達MSN和空載體轉染后的細胞，RIPA溶液溶解細胞，收集總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。各組蛋白質在10%十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉移至PVDF膜。PDVF膜放置5% BSA封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST清洗后加入二抗室溫孵育1 h。TBST清洗后加入ECL溶液后應用激光成像系統顯影。

4. MTT實驗檢測細胞增殖能力

取OV-MSN和OV-VC細胞（2000個/孔）接種到96孔板，分別在0、24、48、72 h后加入四甲基偶氮唑藍（MTT）37℃孵育3 h，加入二甲基亞砜（DMSO）孵育20 min后用ELISA檢測儀讀取每孔吸光度（OD）值，計算細胞增殖率，細胞增殖率 = （實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

5. Transwell實驗和流式細胞學檢測細胞侵襲能力

將1×105個OV-VC和OV-MSN細胞接種于8 μm微孔膜的Transwell小室，上室采用無血清DMEM培養基，下室加入分別含有0.1% BSA/PBS和10% 胎牛血清的DMEM培養基，培養24 h后，棉簽擦拭未穿透微孔膜的細胞，Tanswell微孔膜下層表面細胞應用甲醛固定，0.1%結晶紫染色后，顯微鏡下隨機挑選5個不重復視野拍照。收集Transwell小室的下室細胞，加入Count Bright beads（ThermoFisher，美國）標記活細胞，上流式細胞儀檢測侵襲轉移至下室細胞的數量。

四、統計學處理

應用SPSS 23.0進行數據分析。符合正態分布的臨床數據及體外實驗計量資料采用表示，組間比較應用t檢驗;計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗;采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法檢驗組間差異，采用Cox回歸進行預后影響因素分析;應用GraphPad Prism 8.0軟件進行繪圖。P < 0.05為差異具有統計學意義。

結果

一、進展型HGSOC組織中MSN mRNA的表達

124例進展型HGSOC患者腫瘤組織的MSN mRNA相對表達量為0.06 ～ 3.51，應用X-tile軟件尋找臨界值，以低三分位（T1， 33.3%）為臨界值將患者分為MSN mRNA低表達組（42例）和高表達組（82例）。進展型HGSOC組織中MSN mRNA的表達與患者年齡、腹水情況和術后腫瘤殘余情況均無關（P均> 0.05），見表1。

二、MSN mRNA表達水平與進展型HGSOC患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示，HGSOC患者中MSN mRNA高表達組的OS高于低表達者（χ2= 5.10，P = 0.024），見圖1A;但MSN mRNA高表達組和低表達組的PFS相近（χ2 = 0.30，P = 0.586），見圖1B。進一步分析kmplot數據庫，結果提示MSN mRNA高表達的進展型HGSOC患者的OS高于低表達患者（HR = 0.78，95%CI 0.65 ～ 0.93，P = 0.007），見圖2A;但組間PFS比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖2B。單因素Cox回歸分析顯示，腫瘤殘余和大量腹水均是HGSOC患者OS和PFS的影響因素，但MSN mRNA表達水平僅是OS的影響因素（Wald χ2 = 4.89，P = 0.027），見表2。進一步多因素Cox回歸分析顯示， MSN mRNA高表達是OS的獨立保護因素（HR = 0.51，95% CI 0.31 ～ 0.84，P = 0.009），腫瘤殘余是獨立危險因素（HR = 3.27，95% CI 1.79 ～ 5.98，P < 0.001），見表3。

三、MSN在卵巢腺癌OVMZ-6細胞株中基因與蛋白表達

與未經轉染的OV-WT和轉染空白質粒的OV-VC相比， OV-MSN中MSN mRNA和蛋白表達均比對照組增加，見圖3。

四、MSN高表達抑制卵巢腺癌細胞增殖

MTT結果顯示，OV-MSN培養24、48和72 h的細胞增殖率分別是OV-VC的0.79 倍（t = 2.69，P = 0.016）、0.87倍（t = 4.08，P = 0.001）和0.84倍（t = 2.73，P = 0.015），見圖4。

五、MSN高表達抑制卵巢腺癌細胞遷移

Transwell法和流式細胞學結果顯示，與OV-VC相比，OV-MSN穿膜細胞明顯減少，遷移能力下降，組間比較差異有統計學意義（t = 6.56，P < 0.05），見圖5。

討論

HGSOC是卵巢癌的主要病理類型，由于缺乏特異性的臨床表現和有效的早期檢測手段，患者確診時往往是進展型（FIGO Ⅲ期或Ⅳ期），進展型HGSOC的惡性程度高，預后差。HGSOC的早期診斷困難，術后腫瘤復發率高，患者OS短。因此，深入研究HGSOC發生發展相關的生物標志物，對HGSOC的精準治療具有重要臨床意義。MSN是ERM家族蛋白成員，主要連接肌動蛋白細胞骨架和跨膜受體，參與腫瘤的發生發展。本研究首次在進展型HGSOC中檢測MSN mRNA的表達，并發現MSN mRNA高表達與患者OS相關;進一步通過體外實驗證實MSN過表達的卵巢腺癌細胞增殖和侵襲能力明顯降低，提示MSN表達上調可抑制卵巢腺癌細胞增殖和侵襲，改善HGSOC患者預后。

MSN主要參與細胞形態維持、細胞黏附和細胞活動，是腫瘤發生發展的關鍵蛋白。研究認為MSN廣泛存在于腫瘤組織中，如乳腺癌、口腔鱗狀細胞癌、肺癌和甲狀腺癌等[5-8]。本研究顯示MSN mRNA在進展型HGSOC組織中表達，但相對表達量偏低。Park等[9]在卵巢腺癌細胞OVCAR-3中發現溶血磷脂酸可上調MSN的表達引起卵巢癌細胞侵襲能力上調。本研究分析我院診治的124例FIGO Ⅲ期或Ⅳ期的HGSOC患者發現，MSN mRNA高表達組的OS高于MSN mRNA低表達組，進一步數據庫分析顯示高表達MSN mRNA的進展型HGSOC患者的OS高于低表達的患者，提示MSN mRNA高表達是進展型HGSOC患者OS的保護因素。在一項納入404例乳腺癌患者的研究中，47.8%的乳腺癌組織中MSN蛋白表達陽性，其中MSN蛋白過表達與乳腺癌分期、淋巴轉移和雌激素受體表達陽性相關，同時MSN蛋白過表達的乳腺癌患者PFS短，MSN蛋白過表達是雌激素受體陽性的乳腺癌患者OS的不良預后因素[10]。Alam等[11]發現，在p53突變的乳腺癌細胞中，敲降MSN可逆轉間質上皮化和降低乳腺癌細胞的侵襲能力和對化學治療藥物的耐藥性，提示MSN促進乳腺癌發展。MSN的表達在各類腫瘤中的作用仍未明確。K?bel等（2006年）在105例卵巢癌組織中應用免疫組織化學染色法檢測MSN蛋白表達情況，約48%的卵巢癌組織中檢測到MSN蛋白高表達，單因素分析發現MSN蛋白高表達的卵巢癌患者OS短，但多因素分析MSN蛋白表達水平不是卵巢癌患者預后的獨立影響因素，與本研究結果不一致。究其原因可能為該研究105例卵巢癌中僅包括60例漿液性卵巢癌，且該研究聚焦MSN蛋白的表達，而非MSN mRNA的表達，N端修飾、多肽鏈水解、氨基酸側鏈甲基化、羥化和糖基化等會影響mRNA翻譯后的蛋白表達和活性。

本研究的體外實驗顯示，在卵巢腺癌細胞中過表達MSN可引起卵巢腺癌細胞增殖和侵襲能力下降。有研究者認為前列腺癌細胞中MSN磷酸化后細胞定位改變，可引起前列腺癌細胞增殖和侵襲性下降。另有研究者報道，在口腔鱗狀細胞癌中，MSN的C端區域磷酸化后與肌動蛋白細胞絲結合，N端區域與穿膜分子如podoplanin結合，下游Rho磷酸化，激活下游信號通路引起細胞黏附、細胞增殖和細胞轉移能力改變[6]。Li等[12]在口腔鱗狀細胞癌組織中發現，細胞膜上MSN蛋白表達下調，細胞質中MSN蛋白表達上調，口腔鱗狀細胞癌中MSN沉默后，MSN可能調控MT1-基質金屬蛋白酶和E-鈣黏附蛋白/p120信號通路下調細胞之間黏附性和增加細胞侵襲性。本研究在卵巢腺癌細胞中過表達MSN可引起卵巢腺癌細胞侵襲能力下降，提示在HGSOC中MSN可能介導其他信號通路影響卵巢癌細胞的侵襲能力。與ERM家族蛋白結合的磷酸化蛋白50（EBP50）基因是抑癌基因，Wang等[13]在三陰性乳腺癌細胞中過表達EBP50，體外試驗證實腫瘤細胞黏附、細胞遷移和侵襲能力均明顯下降，同時抑制MMP-2活性。因此，我們推測HGSOC中MSN過表達可能與EBP50結合，抑制基質金屬蛋白酶-2活性，下調卵巢癌侵襲能力有關，但該推測尚需日后進一步研究證實。

綜上所述，MSN mRNA高表達的進展型HGSOC患者OS高于MSN mRNA低表達的進展型HGSOC患者。進一步機制探索顯示MSN可能影響卵巢腺癌細胞增殖和侵襲，其具體機制有待進一步研究探討。本研究表明MSN在HGSOC中具有重要意義，為進展型HGSOC的精準治療提供理論依據。

參 考 文 獻

[1] Flaum N， Crosbie EJ， Edmondson RJ， Smith MJ， Evans DG. Epithelial ovarian cancer risk： a review of the current genetic landscape. Clin Genet， 2020， 97（1）：54-63.

[2] Lisio MA， Fu L， Goyeneche A， Gao ZH， Telleria C. High-grade serous ovarian cancer： basic sciences， clinical and therapeutic standpoints. Int J Mol Sci， 2019， 20（4）：952.

[3] Malinda RR， Zeeberg K， Sharku PC， Ludwig MQ， Pedersen LB， Christensen ST， Pedersen SF. TGFβ signaling increases net acid extrusion， proliferation and invasion in Panc-1 pan-creatic cancer cells： SMAD4 dependence and link to Merlin/NF2 signaling. Front Oncol， 2020， 10：687.

[4] Demacopulo B， Lema BE， Cabrini RL， Kreimann EL. Similar expression pattern of NHERF1 and EZRIN in papillary but not in solid areas of human serous ovarian carcinomas. Acta Histochem， 2016， 118（8）：797-805.

[5] Bartova M， Hlavaty J， Tan Y， Singer C， Pohlodek K， Luha J， Walter I. Expression of ezrin and moesin in primary breast carcinoma and matched lymph node metastases. Clin Exp Metastasis， 2017， 34（5）：333-344.

[6] Assao A， Yoshino PM， Medeiros MCM， Carvalho AL， Soares FA， Kowalski LP， Oliveira DT. Moesin involvement in oral carcinogenesis of the lower lip. Anticancer Res， 2018，? 38（5）：2755-2760.

[7] Kamioka H， Tomono T， Fujita A， Onozato R， Iijima M， Tsuchida S， Arai T， Fujita Y， Zhang X， Yano K， Ogihara T. Moesin-mediated p-glycoprotein activation during snail-induced epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cells. J Pharm Sci， 2020， 109（7）：2302-2308.

[8] Barros FBA， Assao A， Garcia NG， Nonogaki S， Carvalho AL， Soares FA， Kowalski LP， Oliveira DT. Moesin expression by tumor cells is an unfavorable prognostic biomarker for oral cancer. BMC Cancer， 2018， 18（1）：53.

[9] Park J， Jang JH， Oh S， Kim M， Shin C， Jeong M， Heo K， Park JB， Kim SR， Oh YS. LPA-induced migration of ovarian cancer cells requires activation of ERM proteins via LPA1 and LPA2. Cell Signal， 2018， 44：138-147.

[10] Yu L， Zhao L， Wu H， Zhao H， Yu Z， He M， Jin F， Wei M. Moesin is an independent prognostic marker for ER-positive breast cancer. Oncol Lett， 2019， 17（2）：1921-1933.

[11] Alam F， Mezhal F， El Hasasna H， Nair VA， Aravind SR， Saber Ayad M， El-Serafi A， Abdel-Rahman WM. The role of p53-microRNA 200-Moesin axis in invasion and drug resistance of breast cancer cells. Tumour Biol， 2017， 39（9）：1010428317714634.

[12] Li YY， Zhou CX， Gao Y. Moesin regulates the motility of oral cancer cells via MT1-MMP and E-cadherin/p120-catenin adhesion complex. Oral Oncol， 2015， 51（10）：935-943.

[13] Wang L， Qi Y， Xiong Y， Peng Z， Ma Q， Zhang Y， Song J， Zheng J. Ezrin-radixin-moesin binding phosphoprotein 50 （EBP50） suppresses the metastasis of breast cancer and HeLa cells by inhibiting matrix metalloproteinase-2 activity. Anticancer Res， 2017， 37（8）：4353-4360.

（收稿日期：2020-10-07）

（本文編輯：林燕薇）