高級別漿液性卵巢癌中膜突蛋白的表達與意義

祝彩霞?楊娟?袁林靜?牛剛

【摘要】目的 檢測膜突蛋白（MSN）在進展型高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）中的表達情況，分析MSN表達上調(diào)對卵巢腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法 在124例進展型HGSOC標(biāo)本中應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測MSN mRNA的表達情況，分析其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。體外培養(yǎng)卵巢腺癌細(xì)胞OVMZ-6，轉(zhuǎn)染過表達MSN后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR和蛋白免疫印跡法驗證MSN表達變化;分別采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法、Transwell小室實驗和流式細(xì)胞儀檢測MSN表達上調(diào)后對卵巢腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果 進展型HGSOC標(biāo)本均能檢出MSN mRNA的表達，Kaplan-Meier生存分析顯示MSN mRNA高表達者總生存期高于MSN mRNA低表達者（P < 0.05），但無進展生存期組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。多因素Cox回歸分析顯示MSN mRNA高表達是總生存期的獨立保護因素（HR = 0.51，95%CI 0.31 ～ 0.84，P = 0.009）。MSN-pRc/RSV轉(zhuǎn)染后，OVMZ-6細(xì)胞中MSN mRNA和蛋白表達水平顯著上調(diào)。MSN過表達的OVMZ-6細(xì)胞增殖能力和侵襲能力明顯下降（P均< 0.05）。結(jié)論 進展型HGSOC中MSN表達上調(diào)可抑制卵巢腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，影響患者總生存期，提示MSN可能是進展型HGSOC精準(zhǔn)治療的新靶點。

【關(guān)鍵詞】高級別漿液性卵巢癌;膜突蛋白;細(xì)胞增殖;侵襲;預(yù)后

Expression and clinical relevance of moesin in high-grade serous ovarian cancer Zhu Caixia， Yang Juan， Yuan Linjing， Niu Gang. Department of Obstetrics and Gynecology， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China

Corresponding author， Niu Gang， E-mail： Niugang@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To detect the expression level of moesin （MSN） and clinical relevance in advanced high-grade serous ovarian cancer （HGSOC）， and to evaluate the effect of MSN overexpression on cell proliferation and invasiveness in ovarian cancer cell line OVMZ-6. Methods The expression level of MSN mRNA in 124 advanced HGSOC specimens was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）， and its correlation with clinical characteristics and prognosis was analyzed. After stable transfection with overexpressed MSN， the expression level of MSN mRNA and protein of ovarian cancer cell line OVMZ-6 were determined by RT-PCR and Western blot. The effect of MSN on cell proliferation and invasiveness was evaluated by MTT assay， Transwell chamber assay and flow cytometry in vitro. Results MSN mRNA could be detected in all HGSOC tissues. Kaplan-Meier survival analysis showed that elevated MSN mRNA expression predicted longer overall survival （OS） （P < 0.05）， whereas there was no significant association between MSN mRNA and progression-free survival （PFS） （P > 0.05）. Multivariate Coxs regression analysis demonstrated increased MSN mRNA expression was identified as an independent favorable prognostic factor for OS （HR = 0.51，95%CI 0.31 ～ 0.84，P = 0.009）. The expression levels of MSN mRNA and protein were significantly up-regulated after transfection with MSN-pRc/RSV. The cell proliferation and invasiveness were significantly inhibited in ovarian cancer cells transfected with MSN overexpression （all P < 0.05）. Conclusions Overexpression of MSN can suppress cell proliferation and invasiveness of ovarian cancer cells， resulting in longer OS in patients diagnosed with advanced HGSOC. MSN might serve as a novel therapeutic target in advanced HGSOC.

【Key words】High-grade serous ovarian cancer;Moesin;Cell proliferation;Invasiveness;Prognosis

上皮性卵巢癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌，病死率居首位。上皮性卵巢癌主要分為5類：高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）、低級別漿液性卵巢癌（LGSOC）、黏液性卵巢癌、透明細(xì)胞癌和內(nèi)膜樣癌[1]。HGSOC是主要的上皮性卵巢癌類型，占上皮性卵巢癌死亡病例的70% ～ 80%[2]。由于臨床表現(xiàn)不典型和缺乏特異性的檢測手段，患者確診時多為進展型HGSOC（FIGO Ⅲ期或Ⅳ期），治療方式以手術(shù)和化學(xué)治療為主，但自20世紀(jì)80年代以來進展型HGSOC的5年總生存期無明顯改善，僅為15% ～ 25%[2]。膜突蛋白（MSN）是膜-細(xì)胞骨架蛋白（ERM）家族成員之一，主要連接肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜。ERM蛋白包括埃茲蛋白、根蛋白和MSN，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持和細(xì)胞活動的調(diào)節(jié)蛋白之一，參與各類生理和病理過程。有研究發(fā)現(xiàn)，ERM蛋白可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化和影響腫瘤細(xì)胞黏附性，參與腫瘤轉(zhuǎn)移，但另一個家族成員Merlin蛋白則抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[3]。有報道表明，卵巢癌中埃茲蛋白高表達可促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，影響腫瘤復(fù)發(fā)和患者總生存期，但目前關(guān)于MSN在進展型HGSOC中作用的報道缺乏[4]。本研究檢測進展型HGSOC組織中MSN mRNA的表達情況，在卵巢腺癌細(xì)胞OVMZ-6中過表達MSN，體外實驗分別驗證MSN表達上調(diào)對OVMZ-6細(xì)胞的增殖和侵襲的影響，為進展型HGSOC的精準(zhǔn)治療研究提供新的方向。

材料與方法

一、臨床標(biāo)本和資料收集

選取2004年1月至2014年12月在我院行初次全面分期手術(shù)或腫瘤減滅術(shù)、術(shù)后病理診斷確診為HGSOC的124例患者，患者年齡為33 ～ 88歲、中位年齡62歲，臨床分期為FIGOⅢ期或Ⅳ期。所有病例術(shù)前均未進行化學(xué)治療，術(shù)中取新鮮腫瘤組織，凍存用于RNA提取，術(shù)后采用鉑類+紫杉醇（TC）方案化學(xué)治療。所有患者均隨訪5年，總生存期（OS）定義為從首次治療開始至死亡日或終檢值;無進展生存期（PFS）為首次治療至疾病出現(xiàn)進展或任何原因死亡的時間。所有患者均同意所采集的臨床標(biāo)本及相關(guān)資料用于臨床研究，并簽署知情同意書，研究方案符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并取得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（[2017]222號）。另于kmplot數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com）收集進展型HGSOC MSN mRNA低表達與高表達患者的5年生存數(shù)據(jù)。

二、主要材料和試劑

卵巢腺癌細(xì)胞株OVMZ-6、OVCAR-3、CAOV -3由本單位實驗室保存。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑包括DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、脂質(zhì)體（Life Technologies， 美國），嘌呤霉素（Thermofisher， 美國），All Prep DNA/RNA Universal kit （Qiagen， 德國），RNeasy Plus mini kit （Qiagen， 德國），Cloned AMV First-Strand Synthesis System kit （Invitrogen，美國），MSN和內(nèi)參HPRT引物Hs00741306_mH和Hs02800695_m1（Thermofisher， 美國），MSN-pRc/RSV和p-Rc/RSV（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）;四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT， Sigma， 美國），Transwell小室（8 μm， Millipore， 美國），PVDF膜（Millipore， 美國）;相關(guān)蛋白MSN-Antibody（HPA0111335， Sigma， 美國）、GAPDH-Antibody（MAB374， Abcam， 美國）。

三、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

卵巢腺癌細(xì)胞株OVMZ-6和CAOV-3培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，OVCAR-3細(xì)胞株培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。預(yù)實驗?zāi)孓D(zhuǎn)錄PCR檢測顯示OVCAR-3和CAOV-3細(xì)胞中MSN mRNA高表達，OVMZ-6細(xì)胞中MSN mRNA低表達，選取OVMZ-6細(xì)胞進行后續(xù)實驗。取對數(shù)生長期的OVMZ-6細(xì)胞，胰酶消化后接種至6孔板，每孔約2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MSN-pRc/RSV及空載質(zhì)粒pRc/RSV。培養(yǎng)6 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基。隨后應(yīng)用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達MSN的細(xì)胞（OV-MSN，包括克隆1、3、5）和對照組細(xì)胞（OV-VC）以及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的OVMZ-6細(xì)胞（OV-WT）繼續(xù)后續(xù)實驗。

2. 逆轉(zhuǎn)錄PCR

分別提取進展型HGSOC組織和各組卵巢腺癌細(xì)胞的總RNA，Nano drop測定RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成模板DNA，應(yīng)用Taqman PCR反應(yīng)體系對各樣本的MSN mRNA和內(nèi)參HPRT進行定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 3 min預(yù)變性，95℃ 15 s，60℃ 1 min延伸，

共40個循環(huán)。MSN和內(nèi)參HPRT應(yīng)用Hs007 41306_mH和Hs02800695_m1（Thermofisher， 美國）。引物序列如下：MSN正向引物5-AAGTTGCT CCCGCAGAGA-3，反向引物5-TGTTCCTCATG CCACACCT-3，HPRT正向引物5-TGACCTTGAT TATTTTGCATACC-3，反向引物5-CGAGCAAGA CGTTCAGTCCT-3，目的基因相對表達量采用2-??Ct法分析。

3. 蛋白免疫印跡法

收集過表達MSN和空載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，RIPA溶液溶解細(xì)胞，收集總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。各組蛋白質(zhì)在10%十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PDVF膜放置5% BSA封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST清洗后加入二抗室溫孵育1 h。TBST清洗后加入ECL溶液后應(yīng)用激光成像系統(tǒng)顯影。

4. MTT實驗檢測細(xì)胞增殖能力

取OV-MSN和OV-VC細(xì)胞（2000個/孔）接種到96孔板，分別在0、24、48、72 h后加入四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）37℃孵育3 h，加入二甲基亞砜（DMSO）孵育20 min后用ELISA檢測儀讀取每孔吸光度（OD）值，計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率 = （實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

5. Transwell實驗和流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞侵襲能力

將1×105個OV-VC和OV-MSN細(xì)胞接種于8 μm微孔膜的Transwell小室，上室采用無血清DMEM培養(yǎng)基，下室加入分別含有0.1% BSA/PBS和10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棉簽擦拭未穿透微孔膜的細(xì)胞，Tanswell微孔膜下層表面細(xì)胞應(yīng)用甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下隨機挑選5個不重復(fù)視野拍照。收集Transwell小室的下室細(xì)胞，加入Count Bright beads（ThermoFisher，美國）標(biāo)記活細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測侵襲轉(zhuǎn)移至下室細(xì)胞的數(shù)量。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的臨床數(shù)據(jù)及體外實驗計量資料采用表示，組間比較應(yīng)用t檢驗;計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗;采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法檢驗組間差異，采用Cox回歸進行預(yù)后影響因素分析;應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進行繪圖。P < 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、進展型HGSOC組織中MSN mRNA的表達

124例進展型HGSOC患者腫瘤組織的MSN mRNA相對表達量為0.06 ～ 3.51，應(yīng)用X-tile軟件尋找臨界值，以低三分位（T1， 33.3%）為臨界值將患者分為MSN mRNA低表達組（42例）和高表達組（82例）。進展型HGSOC組織中MSN mRNA的表達與患者年齡、腹水情況和術(shù)后腫瘤殘余情況均無關(guān)（P均> 0.05），見表1。

二、MSN mRNA表達水平與進展型HGSOC患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，HGSOC患者中MSN mRNA高表達組的OS高于低表達者（χ2= 5.10，P = 0.024），見圖1A;但MSN mRNA高表達組和低表達組的PFS相近（χ2 = 0.30，P = 0.586），見圖1B。進一步分析kmplot數(shù)據(jù)庫，結(jié)果提示MSN mRNA高表達的進展型HGSOC患者的OS高于低表達患者（HR = 0.78，95%CI 0.65 ～ 0.93，P = 0.007），見圖2A;但組間PFS比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見圖2B。單因素Cox回歸分析顯示，腫瘤殘余和大量腹水均是HGSOC患者OS和PFS的影響因素，但MSN mRNA表達水平僅是OS的影響因素（Wald χ2 = 4.89，P = 0.027），見表2。進一步多因素Cox回歸分析顯示， MSN mRNA高表達是OS的獨立保護因素（HR = 0.51，95% CI 0.31 ～ 0.84，P = 0.009），腫瘤殘余是獨立危險因素（HR = 3.27，95% CI 1.79 ～ 5.98，P < 0.001），見表3。

三、MSN在卵巢腺癌OVMZ-6細(xì)胞株中基因與蛋白表達

與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的OV-WT和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的OV-VC相比， OV-MSN中MSN mRNA和蛋白表達均比對照組增加，見圖3。

四、MSN高表達抑制卵巢腺癌細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，OV-MSN培養(yǎng)24、48和72 h的細(xì)胞增殖率分別是OV-VC的0.79 倍（t = 2.69，P = 0.016）、0.87倍（t = 4.08，P = 0.001）和0.84倍（t = 2.73，P = 0.015），見圖4。

五、MSN高表達抑制卵巢腺癌細(xì)胞遷移

Transwell法和流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，與OV-VC相比，OV-MSN穿膜細(xì)胞明顯減少，遷移能力下降，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 6.56，P < 0.05），見圖5。

討論

HGSOC是卵巢癌的主要病理類型，由于缺乏特異性的臨床表現(xiàn)和有效的早期檢測手段，患者確診時往往是進展型（FIGO Ⅲ期或Ⅳ期），進展型HGSOC的惡性程度高，預(yù)后差。HGSOC的早期診斷困難，術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率高，患者OS短。因此，深入研究HGSOC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，對HGSOC的精準(zhǔn)治療具有重要臨床意義。MSN是ERM家族蛋白成員，主要連接肌動蛋白細(xì)胞骨架和跨膜受體，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究首次在進展型HGSOC中檢測MSN mRNA的表達，并發(fā)現(xiàn)MSN mRNA高表達與患者OS相關(guān);進一步通過體外實驗證實MSN過表達的卵巢腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯降低，提示MSN表達上調(diào)可抑制卵巢腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，改善HGSOC患者預(yù)后。

MSN主要參與細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞黏附和細(xì)胞活動，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵蛋白。研究認(rèn)為MSN廣泛存在于腫瘤組織中，如乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、肺癌和甲狀腺癌等[5-8]。本研究顯示MSN mRNA在進展型HGSOC組織中表達，但相對表達量偏低。Park等[9]在卵巢腺癌細(xì)胞OVCAR-3中發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酸可上調(diào)MSN的表達引起卵巢癌細(xì)胞侵襲能力上調(diào)。本研究分析我院診治的124例FIGO Ⅲ期或Ⅳ期的HGSOC患者發(fā)現(xiàn)，MSN mRNA高表達組的OS高于MSN mRNA低表達組，進一步數(shù)據(jù)庫分析顯示高表達MSN mRNA的進展型HGSOC患者的OS高于低表達的患者，提示MSN mRNA高表達是進展型HGSOC患者OS的保護因素。在一項納入404例乳腺癌患者的研究中，47.8%的乳腺癌組織中MSN蛋白表達陽性，其中MSN蛋白過表達與乳腺癌分期、淋巴轉(zhuǎn)移和雌激素受體表達陽性相關(guān)，同時MSN蛋白過表達的乳腺癌患者PFS短，MSN蛋白過表達是雌激素受體陽性的乳腺癌患者OS的不良預(yù)后因素[10]。Alam等[11]發(fā)現(xiàn)，在p53突變的乳腺癌細(xì)胞中，敲降MSN可逆轉(zhuǎn)間質(zhì)上皮化和降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力和對化學(xué)治療藥物的耐藥性，提示MSN促進乳腺癌發(fā)展。MSN的表達在各類腫瘤中的作用仍未明確。K?bel等（2006年）在105例卵巢癌組織中應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測MSN蛋白表達情況，約48%的卵巢癌組織中檢測到MSN蛋白高表達，單因素分析發(fā)現(xiàn)MSN蛋白高表達的卵巢癌患者OS短，但多因素分析MSN蛋白表達水平不是卵巢癌患者預(yù)后的獨立影響因素，與本研究結(jié)果不一致。究其原因可能為該研究105例卵巢癌中僅包括60例漿液性卵巢癌，且該研究聚焦MSN蛋白的表達，而非MSN mRNA的表達，N端修飾、多肽鏈水解、氨基酸側(cè)鏈甲基化、羥化和糖基化等會影響mRNA翻譯后的蛋白表達和活性。

本研究的體外實驗顯示，在卵巢腺癌細(xì)胞中過表達MSN可引起卵巢腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力下降。有研究者認(rèn)為前列腺癌細(xì)胞中MSN磷酸化后細(xì)胞定位改變，可引起前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲性下降。另有研究者報道，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，MSN的C端區(qū)域磷酸化后與肌動蛋白細(xì)胞絲結(jié)合，N端區(qū)域與穿膜分子如podoplanin結(jié)合，下游Rho磷酸化，激活下游信號通路引起細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力改變[6]。Li等[12]在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜上MSN蛋白表達下調(diào)，細(xì)胞質(zhì)中MSN蛋白表達上調(diào)，口腔鱗狀細(xì)胞癌中MSN沉默后，MSN可能調(diào)控MT1-基質(zhì)金屬蛋白酶和E-鈣黏附蛋白/p120信號通路下調(diào)細(xì)胞之間黏附性和增加細(xì)胞侵襲性。本研究在卵巢腺癌細(xì)胞中過表達MSN可引起卵巢腺癌細(xì)胞侵襲能力下降，提示在HGSOC中MSN可能介導(dǎo)其他信號通路影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。與ERM家族蛋白結(jié)合的磷酸化蛋白50（EBP50）基因是抑癌基因，Wang等[13]在三陰性乳腺癌細(xì)胞中過表達EBP50，體外試驗證實腫瘤細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯下降，同時抑制MMP-2活性。因此，我們推測HGSOC中MSN過表達可能與EBP50結(jié)合，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2活性，下調(diào)卵巢癌侵襲能力有關(guān)，但該推測尚需日后進一步研究證實。

綜上所述，MSN mRNA高表達的進展型HGSOC患者OS高于MSN mRNA低表達的進展型HGSOC患者。進一步機制探索顯示MSN可能影響卵巢腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，其具體機制有待進一步研究探討。本研究表明MSN在HGSOC中具有重要意義，為進展型HGSOC的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-10-07）

（本文編輯：林燕薇）