麻黃細辛附子湯對腎陽虛外感證模型小鼠TLRs應答及Cyt-CO介導的凋亡調控的影響

邢淑雁 范珊珊 于欽輝 馬青云 孫啟慧 楊勇 容蓉

摘 要 目的：研究麻黃細辛附子湯對腎陽虛外感證模型小鼠Toll樣受體（TLRs）應答及細胞色素C氧化酶（Cyt-CO）介導的凋亡調控的影響。方法：將48只雄性Balb/c小鼠隨機分為正常組（n=12）和造模組（n=36）。造模組小鼠采用腹腔注射苯甲酸雌二醇溶液（8 mg/kg）+滴鼻接種甲型H1N1流感病毒（20 μL/只）的方法建立腎陽虛外感復合模型。然后將造模成功的小鼠隨機分為模型組、陽性藥組（磷酸奧司他韋膠囊，0.195 g/kg）和麻黃細辛附子湯組（1.802 g/kg，以生藥總量計），每組12只。各給藥組小鼠灌胃相應藥液，正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水;灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續給藥6天。給藥期間，每天測量小鼠體質量、肛溫，并計算其初始體質量百分率;末次給藥后，計算其臟器（脾、胸腺、肺）指數，觀察其肺組織病理學變化，檢測其肺組織中甲型H1N1流感病毒的病毒載量（以M基因mRNA表達水平反映）以及心臟組織中TLR3、TLR7、髓樣分化因子（MyD88）、胱天蛋白酶3（Caspase-3） mRNA表達水平和Cyt-CO活性、細胞色素C（Cyt-C）含量。結果：與正常組比較，模型組小鼠的初始體質量百分率、肛溫持續降低（P<0.05）;脾指數、胸腺指數均顯著降低（P<0.05），肺指數顯著升高（P<0.05）;肺組織病變嚴重;肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平及Cyt-C含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），心臟組織中Cyt-CO活性顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，麻黃細辛附子湯組小鼠的初始體質量百分率、肛溫自給藥第4天起呈上升趨勢（P<0.05或P<0.01）;脾指數、胸腺指數均顯著升高（P<0.05），肺指數均顯著降低（P<0.05）;肺組織病理損傷明顯改善;肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、Caspase-3 mRNA表達水平和Cyt-C含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），心臟組織中Cyt-CO活性顯著升高（P<0.01）。結論：麻黃細辛附子湯對腎陽虛外感病證模型小鼠具有改善作用，這可能與其可抑制TLRs應答和Cyt-CO介導的凋亡調控途徑有關。

關鍵詞 麻黃細辛附子湯;腎陽虛外感證;細胞色素C氧化酶;細胞色素C;凋亡;Toll樣受體;小鼠

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）06-0669-07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To study the effects of Mahuang xixin fuzi decoction on Toll-like receptors （TLRs） response and cytochrome C oxidase （Cyt-CO）-mediated apoptosis regulation in mice with? influenza disease of kidney-yang deficiency. METHODS： Totally 48 male Balb/c mice were randomly divided into normal group （n=12） and modeling group （n=36）. The modeling group was intraperitoneally injected with estradiol benzoate solution （8 mg/kg） and intranasally injected with influenza virus H1N1 （20 μL/mice） to establish the influenza disease compound model of kidney-yang deficiency. After modeling， the mice were randomly divided into model group， positive drug group （Oseltamivir phosphate capsules， 0.195 g/kg）， Mahuang xixin fuzi decoction group （1.802 g/kg， by crude drug）， with 12 mice in each group. Each group was given relevant medicine intragastrically， normal group and model group were given corresponding volume of normal saline intragastrically 20 mL/kg， once a day， for consecutive 6 days. During admi- nistration， body weight and anal temperature of mice were measured daily; the percentage of initial body weight was calculated. After last medication， the organ （spleen， thymus and lung） indexes were calculated; the pathological changes of lung tissue were observed. The viral load of influenza A virus H1N1 in lung tissue was detected （reflected by M gene mRNA expression）; mRNA expressions of TLR3， TLR7， myeloid differentiation factor （MyD88） and Caspase-3 in cardiac tissue as well as the activity of Cyt-CO and the content of cytochrome C （Cyt-C） were also determined. RESULTS： Compared with normal group， initial body weight percentage and anal temperature of the model group continued to decrease （P<0.05）;the spleen and thymus indexes were decreased significantly （P<0.05）， while lung index was increased significantly （P<0.05）; the lung tissue lesions were serious. Viral load in lung tissue， mRNA expressions of TLR3， TLR7， MyD88 and Caspase-3 in cardiac tissue as well as the content of Cyt-C were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the activity of Cyt-CO in cardiac tissue was significantly decreased （P<0.01）. Compared with model group， initial body weight percentage and anal temperature of mice in Mahuang xixin fuzi decoction group showed an increasing trend from the fourth day of administration （P<0.05 or P<0.01）. The spleen and thymus indexes were increased significantly （P<0.05）， while the lung index was significantly decreased （P<0.05）;the pathological injury of lung tissue was significantly improved; viral load in lung tissue， mRNA expressions of TLR3 and Caspase-3 as well as the content of Cyt-C in cardiac tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the activity of Cyt-CO was increased significantly in cardiac tissue （P<0.01）. CONCLUSIONS： Mahuang xixin fuzi decoction can improve influenza disease of kidney-yang deficiency in mice， the effect may related to inhibit TLRs response and apoptosis regulation pathway mediated by Cyt-CO.

KEYWORDS? ?Mahuang xixin fuzi decoction; Influenza disease of kidney-yang deficiency; Cytochrome C oxidase; Cytochrome C; Apoptosis; Toll-like receptors; Mice

麻黃細辛附子湯始載于《傷寒論》，是治療陽虛兼外感的經方，具有助陽解表、溫經散寒的功效，用于治療素體陽虛、復感寒邪、惡寒發熱等癥，療效顯著[1]。該方由麻黃、細辛、制附子等3味中藥材組成。其中，麻黃辛、溫，入太陽散表寒，為君藥;附子辛熱、溫，補少陰之陽，為臣藥;細辛辛溫，入太陽、少陰，在表可助麻黃發散風寒，在內可助附子扶陽溫腎，為佐藥[2-3]。三藥合用，補散兼施，使外感風寒得以表散，在內陽氣得以溫補，陽虛外感可愈[4-5]。在臨床上，該方主治少陰兼太陽表證，即在陽氣虧虛狀態下感受寒邪出現邪正相爭而導致的發熱（即太少兩感證），是治療陽虛外感寒邪的經典方劑[6]。

Toll樣受體（TLRs）為Ⅰ型跨膜蛋白，是先天免疫系統中的關鍵因子，也是炎癥反應通路的重要信號轉導受體[7]。據相關研究報道，甲型H1N1流感病毒感染心肌組織后，心肌細胞中TLRs表達量增加，然后通過激活TLRs先天免疫應答，引發機體炎癥反應。在致炎因子的刺激下，炎癥介質可誘導線粒體結構功能損傷，使線粒體膜電位降低，并激活胱天蛋白酶（Caspase）信號轉導途徑，使該途徑中作為始動因子的細胞色素C氧化酶（Cyt-CO）活性下降，致使細胞色素C（Cyt-C）被釋放到細胞質中，然后激活凋亡執行因子Caspase-3，進而引發Caspase級聯反應，誘導心肌細胞凋亡[8-11]。此外，作為機體能量代謝中心的線粒體，其自身功能障礙也會直接誘導細胞凋亡[12]。

近年來，對麻黃細辛附子湯干預腎陽虛外感證的研究多集中于藥效及物質基礎方面，已證實了該方對腎陽虛外感證有效，且存在量效關系[5]。因流感病毒侵染機體后，首先激活心肌細胞內TLRs先天免疫應答，進而激活Caspase信號轉導途徑，引起Cyt-CO介導的線粒體調控通路發生變化，從而引發炎癥反應或誘導細胞凋亡[10]。而麻黃細辛附子湯中的附子生物堿成分能影響心肌細胞的線粒體凋亡途徑[13-16]。由此，筆者推測麻黃細辛附子湯干預腎陽虛外感證的機制可能與緩解炎癥損傷及調節心肌細胞凋亡有關。因此，本研究擬建立病證結合的腎陽虛外感復合小鼠模型，并從TLRs應答和Cyt-CO介導的凋亡調控作用出發，通過對其病毒載量、炎癥因子、凋亡基因表達等指標進行測定和評價，探討麻黃細辛附子湯改善腎陽虛外感證模型小鼠的作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BX53型光學顯微鏡（日本Olympus公司）、CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）、NJ 08818型渦旋儀（美國SI公司）、SCIENTZ-50型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、ZIL-2型小鼠自主活動儀（北京醫科院藥研究所）、1510型酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、TDZ5-WS型醫用離心機（湖南平凡科技有限公司）、XP型基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）、CFX Connect Real-Time System熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）和UV-1780型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

麻黃飲片（批號130315）購自泰山中藥有限公司，細辛飲片（批號16050202）購自安徽協和成藥業飲片有限公司，制附子飲片（批號151008）購自四川江油中壩附子科技發展有限公司，以上飲片經山東中醫藥大學藥學院李峰教授鑒定均為真品;AB-8大孔樹脂（粒徑0.3～1.25 mm，批號20190311）購自東鴻化工有限公司;β-環糊精（批號181029）購自曲阜市天利藥用輔料有限公司;雞胚（批號20190123）購自濟南斯派福瑞禽業科技有限公司;苯甲酸雌二醇（批號151102）購自寧波第二激素廠;磷酸奧司他韋膠囊（批號J20140121，規格75 mg）購自上海羅氏制藥有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號120219200908）購自上海碧云天生物技術有限公司;動物組織總RNA提取試劑盒（批號R6927）、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（批號S7806）、SuperReal熒光定量預混試劑-增強版試劑盒（批號S7918）均購自天根生化科技有限公司;小鼠Cyt-C酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（批號20191130）、Cyt-CO活性測定試劑盒（批號20191202）均購自南京建成生物工程研究所;PCR擴增引物由北京六合華大基因科技有限公司設計、合成;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為超純水。

1.3 動物

健康SPF級雄性Balb/c小鼠共48只，體質量為（18±2） g，由山東朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產許可證號為SCXK（魯）2014-0007。動物飼養環境溫度為（22±2） ℃、相對濕度為40%～60%，飼以普通飼料和無菌水。本研究中的動物實驗方案均符合山東中醫藥大學動物倫理委員會標準。

1.4 病毒

甲型H1N1流感病毒鼠肺適應株FM1由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提供。

2 方法

2.1 麻黃細辛附子湯的制備

參照本課題組前期建立的提取方法制備麻黃細辛附子湯[17-18]。稱取細辛30 g（最粗粉），加水240 mL浸泡30 min后，進行回流提取，提取液經八層紗布濾過，收集濾液，記為細辛單煎液;同時收集蒸餾餾分，將餾分上樣到AB-8大孔樹脂柱上進行富集純化，以50%乙醇洗脫，洗脫液經濃縮后，加入等體積乙醚萃取，收集萃取部位，然后用β-環糊精包合（每1 mL揮發油用β-環糊精6 g包合）得到細辛揮發油環糊精包合物0.72 g。取麻黃30 g、附子60 g，加水360 mL浸泡30 min，然后與細辛單煎液合并，煎煮3次，3次煎煮的加水量分別為360、300、300 mL，煎煮時間分別為60、30、30 min，分別以八層紗布濾過，收集濾液。合并3次濾液，減壓濃縮至340 mL，凍干成粉末13.77 g。將凍干粉末13.77 g與細辛揮發油環糊精包合物0.72 g溶于水24 mL中，即得麻黃細辛附子湯，4 ℃保存，備用。

2.2 分組與造模

將小鼠隨機分為正常組（12只）和造模組（36只）。造模組小鼠先腹腔注射苯甲酸雌二醇溶液（8 mg/kg）7天（每天1次）以復制腎陽虛模型[19]。于造模第7天時，從造模的36只小鼠中隨機選擇12只檢測其自主活動次數和5%負重游泳時間，以判斷腎陽虛造模是否成功[20]。然后，參照文獻[21]中滴鼻方法并結合實際調整劑量后，對造模組小鼠按20 μL/只滴鼻接種甲型H1N1流感病毒雞胚尿囊液（血凝滴1 ∶ 640）以建立腎陽虛外感復合模型，并以其出現精神萎靡、畏寒肢冷、形體消瘦、體質量和肛溫明顯降低以及呼吸短促、打噴嚏等癥狀為造模成功的外在表現。將造模成功的小鼠按體質量和腎陽虛外感程度均分為3組，即模型組、陽性藥組和麻黃細辛附子湯組，每組12只。

2.3 給藥

腎陽虛外感復合模型建立24 h后，進行給藥干預。陽性藥組小鼠給予磷酸奧司他韋膠囊0.195 g/kg（人臨床等效劑量，以水為溶劑溶解），麻黃細辛附子湯組小鼠給予麻黃細辛附子湯1.802 g/kg（以生藥總量計，人臨床等效劑量），正常組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水。各組小鼠均灌胃相應藥液或生理鹽水，灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續6天。

2.4 小鼠一般情況觀察

造模期間，每天觀察小鼠的精神狀況、活動狀態，并測定其自主活動次數和5%負重游泳時間[19]。給藥期間，每日測量小鼠體質量、肛溫，記錄其一般體征變化。將給藥前小鼠的體質量定義為初始體質量，計算初始體質量百分率：初始體質量百分率（%）=體質量（g）/初始體質量（g）×100%。

2.5 小鼠臟器指數測定

末次給藥24 h后，脫頸椎處死小鼠，取其脾、胸腺、肺組織，稱定質量，計算各臟器指數：臟器指數=臟器質量（mg）/體質量（10 g）。

2.6 小鼠肺組織病理學觀察

取小鼠肺組織適量于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟包埋、切片（約4 μm），進行常規蘇木精-伊紅（HE）染色，然后在光學顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理學變化。

2.7 小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平測定

采用實時熒光定量PCR法進行測定。取小鼠肺組織和心臟組織各15～20 mg，分別按動物組織總RNA提取試劑盒說明書方法進行總RNA提取。采用紫外-可見分光光度計測定RNA的濃度和純度后，取光密度比值（OD260 nm/OD280 nm）在1.8～2.1之間的樣品，根據FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行操作，在基因擴增儀中（42 ℃孵育15 min;95 ℃孵育3 min;4 ℃冷卻）逆轉錄得到cDNA。以cDNA為模板采用兩步法進行PCR擴增。反應體系（共20 μL）包括2×SuperReal PreMix Plus（含SYBR Green I）10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.6 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。反應條件為95 ℃預變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃延伸32 s，共40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組小鼠肺組織中甲型H1N1流感病毒M基因mRNA表達水平以及心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平。以甲型H1N1流感病毒感染小鼠后其肺組織中M基因mRNA的表達水平反映各組小鼠肺組織中的病毒載量。各基因的引物序列及產物長度見表1。

2.8 小鼠心臟組織中Cyt-CO活性和Cyt-C含量測定

2.8.1 Cyt-CO活性 取小鼠心臟組織10 mg，加入60 μL清理液（Reagent A）清洗1次，移入液氮罐過夜，次日取出并研磨，然后加入預冷的500 μL裂解液（Reagent B），在4 ℃下以13 000 r/min離心5 min，吸取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度后，按照Cyt-CO活性測定試劑盒方法以紫外-可見分光光度計檢測小鼠心臟組織中Cyt-CO的活性。

2.8.2 Cyt-C含量 按每10 mg心臟組織加入磷酸鹽緩沖液（PBS）90 μL的量制備組織勻漿，充分研磨后，以3 000 r/min離心30 min，取上清液。按照Cyt-C ELISA試劑盒說明書方法以酶標儀檢測小鼠心臟組織中Cyt-C的含量。

2.9 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據以x±s表示，造模期間正常組和造模組大鼠的自主活動次數和5%負重游泳時間的組間比較采用獨立樣本t檢驗;給藥后各指標的組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般情況觀察結果

3.1.1 一般體征 正常組小鼠活潑好動，皮毛光亮順滑，反應靈敏，精神狀態良好。造模組小鼠行動遲緩，精神倦怠，皮毛濕軟，形體消瘦。與正常組比較，造模組小鼠自主活動次數顯著減少（P<0.05），5%負重游泳時間顯著縮短（P<0.05），詳見表2。接種病毒后，造模組小鼠初期表現為呼吸短促、偶爾打噴嚏，后期出現靜臥少動、呼吸困難等現象。

3.1.2 初始體質量百分率和肛溫 給藥期間，與正常組比較，模型組小鼠初始體質量百分率及肛溫持續降低（P<0.05），直至解剖時均未見回升的趨勢。自給藥第4天起，各給藥組小鼠的初始體質量百分率、肛溫均出現回升的趨勢;與模型組比較，陽性藥組和麻黃細辛附子湯組小鼠初始體質量百分率和肛溫均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。給藥期間各組小鼠的初始體質量百分率、肛溫變化趨勢見圖1。

3.2 小鼠臟器指數測定結果

與正常組比較，模型組小鼠的脾指數、胸腺指數均顯著降低（P<0.05），肺指數顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽性藥組、麻黃細辛附子湯組小鼠的脾指數、胸腺指數均顯著升高（P<0.05），肺指數均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠的體質量和脾指數、肺指數、胸腺指數測定結果見表3。

3.3 小鼠肺組織病理學觀察結果

正常組小鼠肺組織形態正常，肺間質未見炎性細胞浸潤及明顯的病理實變區;模型組小鼠肺組織病變較嚴重，泡腔變小，肺泡數量明顯減少，肺泡間隔出現不同程度增寬，肺間質內有大量炎性細胞浸潤;給藥治療后，陽性藥組和麻黃細辛附子湯組小鼠的肺組織病變程度均有所改善，其泡腔較模型組均增大，間質內均可見少量炎性細胞，管腔內僅有少量滲出物，肺泡數量增多，且已接近正常形態。各組小鼠肺組織病理切片圖見圖2（圖中箭頭所指為肺組織病變部位）。

3.4 小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平測定結果

與正常組比較，模型組小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，陽性藥組小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平以及麻黃細辛附子湯組小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、Caspase-3 mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠肺組織中病毒載量和心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表達水平測定結果見表4。

3.5 小鼠心臟組織中Cyt-CO活性和Cyt-C含量測定結果

與正常組比較，模型組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性顯著降低（P<0.01），Cyt-C含量顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，陽性藥組和麻黃細辛附子湯組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性均顯著升高（P<0.01），Cyt-C含量均顯著降低（P<0.01）。各組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性和Cyt-C含量測定結果見表5。

4 討論

本研究綜合中醫病證模型（腎陽虛）和西醫致病因素（甲型H1N1流感病毒感染）建立了病證結合的腎陽虛外感復合小鼠模型。造模組小鼠出現了皮毛濕軟、精神倦怠、形體消瘦等腎陽虛癥狀，表現出體質量、肛溫持續下降和呼吸短促等外感癥狀，脾指數和胸腺指數顯著降低，肺指數顯著升高，以上免疫功能低下的表現均提示腎陽虛外感復合模型復制成功[22]。磷酸奧司他韋可與甲型H1N1流感病毒神經氨酸酶活性位點結合，在體內轉化成對甲型H1N1流感病毒有抑制作用的活性代謝物，從而抑制病毒釋放[23]，且可在一定程度上改善體溫下降、體質量降低、精神倦怠等腎陽虛癥狀[24]，最終達到治療腎陽虛外感的目的，故本研究以其作為陽性藥。前期已有多項研究證實，麻黃細辛附子湯干預腎陽虛外感證具有良好的藥效作用，且存在量效關系[5，19]。因此，本研究不再設置麻黃細辛附子湯多劑量組，而是重點探討其在臨床等效劑量下干預腎陽虛外感證可能的作用機制。經給藥治療后，腎陽虛外感復合模型小鼠的體質量、肛溫均出現明顯的回升趨勢;其脾指數和胸腺指數均顯著上升，肺指數均明顯降低;同時其肺組織病理切片顯示，肺泡形態明顯改善且趨近正常。以上結果表明，麻黃細辛附子湯對腎陽虛外感復合病證模型小鼠具有良好的改善作用，能夠有效改善小鼠的機能狀態，減輕其組織病理損傷。

TLRs是天然免疫系統中特異性的病原識別模式受體。其中，TLR3能夠特異性識別病毒雙鏈RNA，激活MyD88依賴的信號轉導通路，介導免疫應答和炎癥反應[25];TLR7能夠識別病毒單鏈RNA，直接與下游的MyD88作用，從而激活天然免疫反應，介導急性炎癥反應[26-27]。甲型H1N1流感病毒感染小鼠后，存在于病毒第7節段編碼的M基因為特征基因，故本研究通過檢測肺組織中M基因mRNA表達水平來反映病毒載量。本研究發現，模型組小鼠肺組織中病毒載量以及心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88 mRNA表達水平均較正常組顯著升高，說明模型小鼠體內炎癥反應強烈，TLRs信號通路被激活。給藥后，與模型組比較，麻黃細辛附子湯組小鼠肺組織中的病毒載量以及心臟組織中TLR3、TLR7、MyD88 mRNA表達水平均不同程度降低，表明麻黃細辛附子湯可通過抑制TLRs先天免疫應答信號通路而減輕炎癥反應。

線粒體途徑作為細胞凋亡中最主要的傳導途徑，不僅受TLRs信號通路的調控，而且線粒體自身的功能障礙也可誘導細胞凋亡[28-30]。Cyt-CO是線粒體電子傳遞鏈末端的氧化酶，其活性下降可導致線粒體內跨膜電位下降，從而打開通透性轉換孔，釋放Cyt-C，進而激活凋亡執行者Caspase-3，最終促進細胞凋亡[31-32]。本研究發現，與正常組比較，模型組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性顯著降低，Cyt-C含量顯著升高，且心臟組織中Caspase-3 mRNA表達水平亦顯著升高，表明造模小鼠出現了明顯的心肌細胞凋亡現象。給藥后，麻黃細辛附子湯組小鼠心臟組織中Cyt-CO活性顯著升高，Cyt-C含量顯著降低，且心臟組織中Caspase-3 mRNA表達水平亦顯著降低，表明麻黃細辛附子湯能夠通過有效調控線粒體凋亡信號通路而抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，麻黃細辛附子湯可通過抑制TLRs先天免疫應答信號通路中TLR3、TLR7、MyD88 mRNA的表達來抑制炎癥反應，從而減輕炎癥反應所致的臟器損傷，并通過下調Cyt-CO介導的心肌細胞凋亡相關信號轉導因子Caspase-3及Cyt-C的表達，進而抑制心肌細胞凋亡，這可能是麻黃細辛附子湯對腎陽虛外感病證模型小鼠具有良好的干預作用的機制之一。

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（收稿日期：2020-12-07 修回日期：2021-01-30）

（編輯：林 靜）