miR-338-3p靶向FBXW7調控ox-LDL誘導的內皮細胞氧化應激和凋亡

鄧永宜 何永橋 陳潔

動脈粥樣硬化是臨床常見疾病，也是心腦血管病的主要病理基礎，其發病機制尚未完全清楚，且臨床缺乏特異性的治療藥物[1]。血管內皮細胞是血管壁的主要屏障，其損傷和功能障礙是動脈粥樣硬化發生的始動環節[2]。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可損傷內皮細胞，促進動脈粥樣硬化的發生發展[3]。探討影響ox-LDL誘導的內細細胞損傷的分子機制對于動脈粥樣硬化治療靶點的尋找具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，可與其靶基因的3’端非翻譯區(3’untranslated region，3’UTR)靶向結合，抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA，調控靶基因的表達，在細胞增殖、凋亡、氧化應激和炎癥等一系列生命活動中發揮重要作用[4，5]。研究顯示，miR-338-3p在卵巢癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌等腫瘤細胞中表達下調，過表達miR-338-3p可抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為，是腫瘤治療的潛在靶點[6-8]。但miR-338-3p對內皮細胞損傷的影響及機制尚不明確。Target scan生物信息學軟件預測顯示，F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7，FBXW7)是miR-338-3p的靶基因。FBXW7是SCF類泛素連接酶E3復合體中特異性識別底物的關鍵因子，參與調節細胞生長和凋亡等生命過程[9]。有報道FBXW7是體外內皮屏障功能的新型調節劑，其表達缺失通過間接調節Ras同源物基因家族成員B的活性，導致內皮細胞收縮力增加和內皮屏障破壞[10]。目前，miR-338-3p能否通過調節FBXW7參與內皮細胞損傷還未知。因此，本研究采用ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，探討miR-338-3p靶向調控FBXW7對HUVECs細胞氧化應激和凋亡的影響及其機制，以期為動脈粥樣硬化的靶向分子治療提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與實驗試劑 HUVECs細胞(中國科學院上海細胞庫)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、高糖DMEM培養基、四甲基噻唑藍(methylthiazoletrazolium，MTT)、胰蛋白酶、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒、膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，(美國Sigma公司)，LipofectamineTM 2000試劑盒(美國Invitrogen公司)，RNA抽屜試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，兔抗人FBXW7單克隆抗體和活化的半胱天冬酶-3多克隆抗體(Cleaved caspase-3)(美國Abcam公司)，miR-338-3p 模擬物(mimcs)及模擬陰性序列(miR-con)、miR-338-3p抑制劑(anti-miR-338-3p組)及抑制劑陰性序列(anti-miR-con)、FBXW7的小干擾RNA(si-FBXW7)及亂序無意義陰性序列(si-NC)(廣州市銳博生物科技有限公司)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 HUVECs細胞培養和轉染：HUVECs復蘇后，加入含10% FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO2、濕度97%培養箱中培養。每2～3天更換一次新鮮的培養基。當細胞生長密度為80%～90%時，0.25 %胰蛋白酶消化，以1∶3比例進行傳代培養。取對數生長期的HUVECs細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞。當細胞生長密度為60%左右時，更換不含FBS的DMEM培養基。參照LipofectamineTM 2000試劑盒說明書，將anti-miR-338-3p、anti-miR-con、anti-miR-338-3p與si-FBXW7、anti-miR-338-3p與si-con轉染至細胞。轉染后24 h，更換含10 % FBS的DMEM培養基。繼續培養24 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組：HUVECs細胞分為空白組、ox-LDL組(50 mg/L[11]ox-LDL誘導細胞)、ox-LDL+anti-miR-338-3p組(50 mg/L ox-LDL誘導轉染anti-miR-338-3p的細胞)、ox-LDL+anti-miR-con組(50 mg/L ox-LDL誘導轉染anti-miR-con的細胞)、ox-LDL+anti-miR-338-3p+si-FBXW7組(50 mg/L ox-LDL誘導共轉染anti-miR-338-3p和si-FBXW7的細胞)和ox-LDL+anti-miR-338-3p+si-con組(50 mg/L ox-LDL誘導共轉染anti-miR-338-3p和si-con的細胞)。每組設置3個復孔，各組細胞培養24 h后檢測指標變化。實驗重復3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中miR-338-3p和FBXW7 mRNA表達：RNA抽屜試劑盒試劑提取細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA濃度并進行定量。采用逆轉錄試劑盒將RNA合成為cDNA，以cDNA為模板擴增。引物序列：miR-338-3p上游5’-GTGCGAGTCGAGGCTGAACG-3’，下游5’-CGTGAAACGTGTAGCTGAT-3’；FBXW7上游5’-AAAGAGTTGT-TAGCGGTTCTCG-3’，下游5’-CCACATGGATACCAT-CAAACTG-3’；GAPDH上游5’-CGGATTTGGTCGTATTGGGC-3’，下游5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT T-3’；U6上游5’-CGTGAAGCTGCCACGTACTG-3’，下5’-CCGATAACGTGTGGCGCGTG-3’。擴增程序：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個循環。miR-338-3p以U6為內參，FBXW7以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算miR-338-3p和FBXW7 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 Western blot法檢測FBXW7和Cleaved caspase-3蛋白表達：細胞中加入RIPA蛋白裂解液，于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min，上清即為提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度后定量。取蛋白溶液，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離蛋白轉至聚偏乙烯二氟膜，于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別用FBXW7和Cleaved caspase-3抗體4℃孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗37℃孵育1 h。洗膜后，滴加ELC顯影液，避光顯影后凝膠成像系統曝光拍照。

1.2.5 酶聯免疫吸附法檢測細胞培養上清液中LDH及細胞中MDA含量、SOD和GSH-Px活力：細胞培養24 h后，收集上清液，3 500 r/min離心5 min，分別參照LDH試劑盒檢測上清中LDH含量。胰蛋白酶消化細胞，分別參照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒檢測細胞中MDA含量和SOD、GSH-Px活力。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡：細胞培養24 h后，吸棄培養基，胰蛋白酶消化細胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，取1.0×106個細胞，加入500 μl結合緩沖液，混懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC。室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 miR-338-3p與FBXW7靶向關系驗證：PCR擴增含miR-338-3p結合位點的FBXW7的3’UTR序列，克隆至pmir GLO載體，構建FBXW7野生型雙熒光素報告質粒(WT-FBXW7)。利用基因定點突變技術將結合位點突變后，克隆至pmir GLO載體，構建FBXW7突變型雙熒光素報告質粒(MUT-FBXW7)。分別將FBXW7-WT或FBXW7-MUT與miR-338-3p mimics、miR-con、anti-miR-con、anti-miR-338-3p共轉染至HUVECs細胞。轉染24 h后，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性，結果以熒光蟲活性/海腎熒光強度比值表示各組的熒光素酶活性。同時分別轉染miR-338-3p mimics、miR-con、anti-miR-con、anti-miR-338-3p至HUVECs細胞，轉染24 h后，更換含10 %FBS的DMEM培養基。繼續培養24 h后，Western blot法檢測各組細胞中FBXW7蛋白表達，方法同1.2.4。

2 結果

2.1 ox-LDL對HUVECs細胞miR-338-3p和FBXW7表達的影響 與空白組比較，ox-LDL組miR-338-3p水平升高(P<0.05)，FBXW7 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western blot檢測ox-LDL誘導HUVECs細胞后FBXW7蛋白表達

表1 ox-LDL誘導HUVECs細胞后miR-338-3p和FBXW7表達水平

2.2 抑制miR-338-3p對ox-LDL誘導的HUVECs細胞氧化應激的影響 與空白組比較，ox-LDL組MDA和LDH含量升高(P<0.05)，GSH-PX和SOD活力降低(P<0.05)。與ox-LDL+anti-miR-con組比較，ox-LDL+anti-miR-338-3p組MDA和LDH含量降低(P<0.05)，GSH-PX和SOD活力升高(P<0.05)。見表2。

表2 抑制miR-338-3p對ox-LDL誘導的HUVECs細胞氧化應激的影響

2.3 抑制miR-338-3p對ox-LDL誘導的HUVECs細胞凋亡的影響 與空白組比較，ox-LDL組細胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)。與ox-LDL+anti-miR-con組比較，ox-LDL+anti-miR-338-3p組細胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 抑制miR-338-3p對ox-LDL誘導的HUVECs細胞凋亡和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響；A：流式細胞術檢測HUVECs細胞凋亡；B：Western blot檢測Cleaved caspase-3蛋白表達

表3 抑制miR-338-3p后ox-LDL誘導的HUVECs細胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達水平

2.4 miR-338-3p靶向FBXW7調控其表達 Target scan生物信息學軟件預測顯示， miR-338-3p與FBXW7的3’UTR存在連續結合位點。與miR-con組比較，miR-338-3p組共轉染WT-FBXW7的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而不影響MUT-FBXW7的熒光素酶活性(P>0.05)。與anti-miR-con組比較，anti-miR-338-3p組共轉染WT-FBXW7的熒光素酶活性顯著升高(P<0.05)，而不影響MUT-FBXW7的熒光素酶活性(P>0.05)。miR-338-3p組FBXW7蛋白水平低于miR-con組(P<0.05)，anti-miR-338-3p組FBXW7蛋白水平高于anti-miR-con組(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 miR-338-3p靶向調控FBXW7表達；A miR-338-3p與FBXW7的靶向結合位點；B Western blot檢測miR-338-3p對HUVECs細胞中FBXW7蛋白表達的影響

表4 雙熒光素酶報告實驗結果和miR-338-3p對FBXW7蛋白表達的影響

2.5 沉默FBXW7降低抑制miR-338-3p對ox-LDL誘導的HUVECs細胞的保護作用 與ox-LDL+anti-miR-338-3p+si-con組比較，ox-LDL+anti-miR-338-3p+si-FBXW7組MDA和LDH含量升高(P<0.05)，GSH-PX和SOD活力降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 si-FBXW7和anti-miR-338-3p對ox-LDL誘導HUVECs細胞損傷的影響

圖4 si-FBXW7和anti-miR-338-3p對HUVECs細胞凋亡的影響；A Western blot檢測FBXW7和Cleaved caspase-3蛋白表達；B流式細胞術檢測HUVECs細胞凋亡

3 討論

內皮細胞功能紊亂是一個復雜的過程，其是動脈粥樣硬化形成的重要原因。ox-LDL可誘導內皮細胞產生氧化應激損傷、血管收縮性改變等病理性損傷的發生，進而促進動脈粥樣硬化的發展[12]。細胞受損時，細胞膜通透性增加，導致LDH漏出，因此，細胞培養上清中LDH含量可反映細胞受損程度[13]。MDA是脂質過氧化產物之一，其含量高低可間接反映細胞氧化應激水平[14]。GSH-PX和SOD時機體內重要的抗氧化酶，可清除自由基保護機體組織受損[15]。本研究顯示，ox-LDL作用HUVECs細胞后，細胞培養上清液中MDA和LDH含量升高，細胞中GSH-PX和SOD活力降低，提示在ox-LDL誘導作用下，HUVECs細胞產生氧化應激損傷。血管內皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化病理發生的早期事件，可促進粥樣硬化病變形成[16]。本研究顯示，ox-LDL作用HUVECs細胞后，細胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達升高，提示ox-LDL可能通過促進Cleaved caspase-3蛋白表達誘導HUVECs細胞凋亡。

miRNA參與調控內皮細胞結構和功能、增殖、凋亡及遷移等過程，與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關。Yin等[17]研究顯示，ox-LDL可促進HUVECs細胞表達miR-338-3p，且抑制miR-338-3p表達可降低ox-LDL誘導的HUVECs細胞凋亡，與本研究結果一致，提示miR-338-3p可能參與動脈粥樣硬化形成。本研究還顯示，抑制miR-338-3p可降低ox-LDL誘導的HUVECs細胞培養上清液中MDA和LDH含量，提高細胞中GSH-PX和SOD活力，提示抑制miR-338-3p表達可降低ox-LDL誘導的HUVECs細胞氧化應激，miR-338-3p可能是動脈粥樣硬化治療的分子靶點，靶向下調其表達可延緩動脈粥樣硬化發展進程。

生物信息學軟件預測顯示，FBXW7可能是miR-338-3p的靶基因。研究表明，FBXW7參與血管內皮細胞遷移、內皮屏障完整性、血管生成以及動脈粥樣硬化斑塊形成等過程[18]，在心血管疾病發生發展過程中起重要作用。為了進一步探討抑制miR-338-3p表達降低ox-LDL誘導的HUVECs細胞氧化應激和凋亡的作用機制，本研究通過雙熒光素酶活性檢測證實了miR-338-3p可與FBXW7的3’UTR靶向結合。此外，抑制miR-338-3p表達后，HUVECs細胞中FBXW7蛋白表達升高，而上調miR-338-3p表達后，FBXW7蛋白表達降低，進一步證實了miR-338-3p在HUVECs細胞中靶向負調控FBXW7表達。這也與ox-LDL誘導的HUVECs細胞后，miR-338-3p表達升高，而FBXW7的mRNA和蛋白表達降低的結果一致。本研究還顯示，沉默FBXW7降低了抑制miR-338-3p對ox-LDL誘導的HUVECs細胞氧化應激和凋亡的抑制作用，提示miR-338-3p通過靶向上調FBXW7表達保護ox-LDL誘導的HUVECs細胞損傷。

綜上所述，ox-LDL可誘導HUVECs細胞產生氧化應激和凋亡，損傷細胞。抑制miR-338-3p表達可能通過上調FBXW7表達降低，ox-LDL誘導的HUVECs細胞氧化應激和凋亡，保護內皮細胞損傷，可能是動脈粥樣硬化的治療的潛在靶點。