基于Sonic Hedgehog通路探討復方胃炎合劑干預慢性萎縮性胃炎癌前病變的機制

黃銘涵　李思漢　田琳　林平　鄭榕　施婧瑤　林秀明

〔摘要〕 目的 觀察復方胃炎合劑對慢性萎縮性胃炎癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer， PLGC）脾虛痰濕熱瘀證大鼠 Sonic Hedgehog （Shh）通路相關基因表達的影響，并探討其抑制PLGC進展的機制。方法 SPF級雄性Wistar大鼠隨機分為空白組、空白+中藥組、模型組、維酶素組、中藥低劑量組、中藥中劑量組和中藥高劑量組，每組8只。造模組采用復合造模法構建PLGC脾虛痰濕熱瘀證大鼠模型，造模成功后，各組予以相應干預，干預30 d后進行標本采集，采用HE染色檢測大鼠胃黏膜病變情況，RT-qPCR檢測胃組織Shh通路相關基因SHH、PTCH1、SMO、Gli1、Gli2、Gli3 mRNA 的表達。結果 HE染色提示空白組和空白+中藥組大鼠胃組織病理組織學正常，模型組大鼠胃黏膜萎縮，并可見腸上皮化生（intestinal metaplasia， IM）和上皮內瘤變（intraepithelial neoplasia， IN）;維酶素組和中藥各劑量組病理組織學可見不同程度改善，以中藥中、高劑量組改善最為明顯。與空白組比較，模型組大鼠SHH、SMO、PTCH、Gli1 mRNA表達量下降，Gli2、Gli3 mRNA表達量上升，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。與模型組比較，各治療組大鼠胃組織SHH、SMO、PTCH、Gli1 mRNA表達量均上升，Gli2、Gli3 mRNA表達量均降低，其中空白+中藥組、維酶素組、中藥中劑量組、中藥高劑量組SHH、SMO、PTCH mRNA表達差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），中藥高劑量組大鼠胃組織Gli1 mRNA表達差異有統計學意義（P<0.05），空白+中藥組、維酶素組、中藥中劑量組、中藥高劑量組大鼠胃組織Gli2 mRNA表達差異有統計學意義（P<0.01），中藥各劑量組Gli3 mRNA表達差異無統計學意義（P>0.05）。結論 復方胃炎合劑可通過激活Shh通路改善胃黏膜病變，從而抑制PLGC的進展。

〔關鍵詞〕 慢性萎縮性胃炎癌前病變;復方胃炎合劑;Sonic Hedgehog通路;機制研究;大鼠

〔中圖分類號〕R259? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.013

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of compound gastritis mixture on the related genes expression of Sonic Hedgehog （Shh） pathway in rats with spleen deficiency， dampness-heat and blood stasis syndrome of precancerous lesions of gastric cancer （PLGC）， and to explore its mechanism of inhibiting the progression of PLGC. Methods SPF male Wistar rats were randomly divided into the blank group， the blank + traditional Chinese medicine （TCM） group， the model group， the vitacoenzyme group， the low-dosage TCM group， the medium-dosage TCM group， and the high-dosage TCM group， with 8 rats in each group. The rat model of spleen deficiency， dampness-heat， and blood stasis syndrome of PLGC was established by compound modeling method. After the model was successfully established， each group was given 30 days of related interventions. Then， stomach specimens were collected and the pathological changes of gastric mucosa were detected by HE staining， and the related genes expression of Shh pathway of SHH， PTCH， SMO， Gli1， Gli2 and Gli3 mRNA in gastric tissue was detected by RT-qPCR. Results HE staining showed that the histopathology of gastric tissue in the blank group and the blank + TCM group was normal， however， atrophy， intestinal metaplasia （IM） and intraepithelial neoplasia （IN） could be seen in the gastric mucosa of rats in the model group; the histopathology of the vitacoenzyme group and each dose of TCM group were improved in varying degrees， especially in the medium-dosage TCM group and the high-dosage TCM group. Compared with the blank group， the expressions of SHH， SMO， PTCH and Gli1 mRNA in the model group decreased， while the expressions of Gli2 and Gli3 mRNA increased， and the differences were statistically significant （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， the expressions of SHH， SMO， PTCH and Gli1 mRNA in gastric tissue of rats in each treatment group increased， while the expressions of Gli2 and Gli3 mRNA decreased， among them， there were significant differences in the expressions of SHH， SMO and PTCH mRNA in the blank + TCM group， the vitacoenzyme group， the medium-dosage TCM group， and the high-dosage TCM group （P<0.05， P<0.01）， there were significant difference in the expression of Gli1 mRNA in gastric tissue of rats in the high-dosage TCM group （P<0.05）， the expression of Gli2 mRNA in gastric tissue of rats in the blank + TCM group， the vitacoenzyme group， the medium-dosage TCM group， and the high-dosage TCM group was decreased significantly （P<0.01）， while the expression of Gli3 mRNA in each dosage TCM group was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion Compound gastritis mixture can improve the pathological change of gastric mucosa by reactivating Shh pathway， thus inhibiting the progression of PLGC.

〔Keywords〕? precancerous lesions of gastric cancer; compound gastritis mixture; Sonic Hedgehog pathway; mechanism research; rat

胃癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發病率和死亡率居我國消化系統惡性腫瘤之首，胃鏡檢出率為7.5%～13.8%[1]。慢性萎縮性胃炎癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer， PLGC）是指在慢性萎縮性胃炎基礎上胃黏膜的異常改變，主要包括胃黏膜不完全型腸上皮化生和中、重度不典型增生[2]。目前，多數研究者認同的演變模式為：慢性胃炎→胃黏膜萎縮→腸上皮化生（intestinal metaplasia， IM）→上皮內瘤變（intraepithelial neoplasia， IN）→胃癌[2]。因此，阻斷或逆轉PLGC進展是降低胃癌發生率的有效措施。復方胃炎合劑是在國醫大師楊春波教授創制的“胃炎1號”[3]“胃炎合劑”[4]基礎上，結合中醫證素研究[5]優化而成，臨床治療PLGC療效顯著[6]。相關研究[7-8]證實，Sonic Hedgehog（Shh）信號通路分子的異常表達與PLGC的發生、進展關系密切。因此，本文以Shh信號通路為切入點，研究復方胃炎合劑阻斷或逆轉PLGC進程的作用機制，以期為復方胃炎合劑的臨床應用提供依據。

1 實驗材料

1.1? 動物

選擇健康Wistar大鼠59只，雄性，體質量為（110±10） g，SPF級，購于上海萊斯克實驗動物有限公司[動物許可證號SCXK（滬）2017-0005]，飼養于福建中醫藥大學SPF級動物實驗中心，分籠飼養，環境溫度21～25 ℃，空氣濕度50%～60%。所有實驗均按照福建中醫藥大學附屬第二人民醫院倫理委員會和國際動物福利標準的指導方針進行[9]。

1.2? 藥物

復方胃炎合劑湯藥由福建中醫藥大學附屬第二人民醫院藥劑室制備。復方胃炎合劑由14味藥物組成：炙黃芪150 g，黨參100 g，茯苓150 g，炒白術100 g，枳殼60 g，白芍100 g，砂仁45 g，法半夏100 g，佩蘭100 g，黃連30 g，地龍干150 g，莪術60 g，陳皮60 g，甘草30 g。將藥物浸泡于8倍量水中0.5 h，隨后煎煮3次，時間分別為1.5、1.0、0.5 h，合并煎液并過濾。在60～70 ℃下減壓濃縮濾液至500 mL，含生藥2.47 g/mL，滅菌分裝，冷藏至4 ℃備用。維酶素片（規格0.2 g/片，北海陽光藥業有限公司，批號：190105）;鹽酸雷尼替丁膠囊（規格0.15 g/粒，賽諾菲杭州制藥有限公司，批號：4061）。

1.3? 主要試劑

1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（貨號M0527）購自北京百靈威科技有限公司;TRNzol總RNA提取試劑盒（貨號DP424）購自北京天根生化科技有限公司;去基因組逆轉錄試劑盒（貨號RR047B）、熒光定量混合液（貨號RR82LR）、DNA梯度標志物（貨號3427Q）均購自日本寶日醫生物技術（北京）有限公司;引物購自美國Invitrogen公司，引物序列見表1。

1.4? 主要儀器

低溫冷凍離心機（德國Eppendrof公司，型號5424R）;渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號QL-902）;分光光度計（美國Thermo scientific公司，型號NANODROP 2000）;熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司，型號ABI7500）;紫外分光光度計（美國NanoDrop公司，型號ND-2000）;凝膠成像系統（上海天能科技有限公司，型號Tanon 1600）。

2 實驗方法

2.1? 模型構建

2.1.1? 疾病模型構建? 造模組參考文獻[10-12]加以改進進行造模：（1）以120 μg/mL 1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍溶液作為飲用水自由飲用;（2）雷尼替丁0.03 g/（kg·d）灌胃;（3）45%乙醇空腹灌胃，每周2次，2 mL/次;（4）每周禁食1次，每次24 h。以上述方法連續造模24周。造模結束后，隨機抽取3只大鼠麻醉，取胃，行病理檢查，如病理由高年資病理科醫師審閱復核，提示胃組織黏膜萎縮，同時見IM和IN，則判斷PLGC模型構建成功[11]。

2.1.2? 證候模型構建? PLGC造模成功后，課題組參考文獻[13-14]加以改進。造模組大鼠單日禁食、自由飲水，雙日足量高脂高糖飲食、20%蜂蜜水自由飲用，隔日上午灌服油脂l0 g/（kg·d），下午灌服56°白酒10 mL/kg;第15天開始放入人工氣候箱中，溫度30～34 ℃，相對濕度95%，連續5 d。經以上造模干預，造模組大鼠背毛蓬松、色偏黃、無明顯光澤，喜扎堆，唇周色暗，小便量多色黃，大便便溏或黏稠發暗、餿臭明顯，舌質稍紫，尾色瘀青，符合脾虛痰濕熱瘀證的模型特點。

2.2? 分組及干預

Wistar大鼠采用隨機數字法分為2組?？瞻讓φ战M16只，隨機分為空白組、空白+中藥組，每組8只，給予SPF級動物標準飲食喂養。造模組43只，按“2.1”方法構建模型后選取40只大鼠，隨機分為模型組、維酶素組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組8只。參考成人平均體質量60 kg，根據臨床用藥劑量與動物用量的劑量換算，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、空白+中藥組大鼠，每日以復方胃炎合劑原液灌胃，量分別為2.5、5、10、10 mL/（kg·d），根據大鼠體質量用生理鹽水稀釋藥液至每次5 mL/只。維酶素組大鼠予以維酶素混懸液灌服，根據大鼠體質量，按0.2 g/（kg·d）灌胃，每次5 mL/只?？瞻捉M、模型組給予生理鹽水灌胃，每次5 mL/只。藥物干預共30 d。

2.3? 標本采集

藥物干預結束后，大鼠予禁食12 h，隨后放入大小適中、放有乙醚棉球的透明玻璃罩中進行麻醉。麻醉成功后沿腹部正中線剖開腹腔，分離胃，沿胃大彎剖開，放入生理鹽水漂洗，取幽門與前胃和腺胃交界線連線的2/5部分，放入凍存管后立即置于液氮中速凍，隨后-80 ℃凍存備用;將胃竇部放入10%福爾馬林液中固定備用。

2.4? 指標檢測

2.4.1? HE染色觀察病理組織學改變? 胃竇部經石蠟包埋后，用切片機連續切片5張，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠胃黏膜病理組織學情況。

2.4.2? RT-qPCR檢測相關mRNA表達? 采用 TRNzol總RNA提取試劑盒進行樣本RNA提取，使用紫外分光光度計，采用紫外吸收法進行RNA濃度和純度測定，再采用去基因組逆轉錄試劑盒進行cDNA反轉錄，實驗操作嚴格按產品說明書進行，PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min后進入40個循環擴增階段，循環條件為：95 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s;最后于72 ℃延伸5 min。

2.5? 統計學方法

所有數據用SPSS 20.0統計軟件進行處理，數據用“x±s”表示。對相關數據進行正態及方差齊性檢驗，如符合正態分布、方差齊性，采用單因素方差分析方法，并采用LSD檢驗進行組間兩兩比較;若不符合正態分布，則采用Kruskal-Wallis H檢驗進行分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組大鼠胃組織病理學情況比較

空白組和空白+中藥組大鼠胃組織形態結構無異常，可見結構完整、排列整齊的胃黏膜細胞和腺體;模型組大鼠胃黏膜層變薄，且腺泡減少，腺管不完整，伴有明顯炎癥細胞浸潤，可見IM和IN;維酶素組和中藥各劑量組大鼠胃黏膜組織厚度均不同程度增加，腺泡均增加，可見黏膜下層和肌層增厚。維酶素組和中藥低劑量組細胞大小較為均一，但細胞排列仍不甚規則;中藥中、高劑量組大鼠胃黏膜細胞腺管結構相對完整，細胞核形狀、大小較為均勻，排列較為整齊，未見明顯炎性細胞浸潤。見圖 1。

3.2? 各組大鼠胃組織SHH、SMO、PTCH mRNA表達水平比較

與空白組比較，模型組SMO、SHH、PTCH mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，各治療組SMO、SHH、PTCH mRNA表達水平均有所升高，其中維酶素組、中藥中劑量組、中藥高劑量組差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。與維酶素組比較，中藥各劑量組SHH mRNA表達水平差異無統計學意義（P>0.05）;中藥低、中劑量組SMO mRNA表達水平差異無統計學意義（P>0.05），中藥高劑量組顯著上升（P<0.05）;中藥低劑量組PTCH mRNA表達水平下降（P<0.05），但中藥中、高劑量組表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

3.3? 各組大鼠胃組織Gli1、Gli2、Gli3 mRNA表達水平比較

與空白組比較，模型組Gli1 mRNA表達水平顯著降低（P<0.05），Gli2、Gli3 mRNA表達水平顯著升高（P<0.05，P<0.01）。與模型組比較，維酶素組、中藥低、中劑量組Gli1 mRNA表達水平有所升高，但差異無統計學意義（P>0.05），中藥高劑量組Gli1 mRNA表達水平顯著升高（P<0.05），中藥低劑量組Gli2 mRNA表達水平無顯著變化（P>0.05），維酶素組、中藥中、高劑量組Gli2 mRNA表達水平顯著降低（P<0.01）;維酶素組和中藥各劑量組Gli3 mRNA表達水平均有所降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。與維酶素組比較，中藥低劑量組Gli2 mRNA表達水平升高（P<0.05）。見表3。

4 討論

在前期研究中[5，15-17]，課題組以證素辨證為手段，結合福建地域特點，認為PLGC以脾胃氣虛為本，以痰、濕、熱、瘀為標[5]。多因稟賦不足、飲食不節、情志失調、外邪犯胃等因素，致脾胃虧虛，濕、熱邪氣膠著于胃脘部，釀而生痰，日久入絡，化生瘀毒，從而損傷黏膜組織，致胃黏膜IM及異型增生[16]。如《靈樞·百病始生》曰：“是故虛邪之中人也……留而不去，則傳舍于絡脈……留而不去，傳舍于經……留著于脈，稽留而不去，息而成積。”因此，在PLGC病機演化的過程中，脾胃虧虛為發病基礎，濕熱邪氣貫穿始終，痰瘀為病變關鍵病理因素。在總結“胃炎1號”[3]“胃炎合劑”[4]療效基礎上進一步優化，擬定“復方胃炎合劑”。方中黃芪、黨參同用，健脾養胃、甘溫益氣;白術健脾燥濕，茯苓健脾滲濕，苓術相配，健脾益氣、祛濕之功益著;以上諸藥合用，治虛以補后天之本。配法半夏、佩蘭、黃連、白豆蔻、陳皮清熱祛痰，砂仁、枳殼行氣調中、化濕消痞，白芍和營緩急止痛，莪術、地龍逐瘀舒絡。諸藥并用，共奏健脾清化舒絡之功，旨在驅邪扶正、標本兼顧，復脾胃健運之職，以期使萎縮、腸化、異型增生得以漸次逆轉。

既往研究[7-8，18]發現，胃黏膜上皮細胞Shh信號轉導通路在PLGC的發病過程中扮演了重要的角色。Hedgehog由Nusslein-Volhard和Wiesehaus在研究果蠅的基因突變時發現，1992年成功克隆出該基因[7]。在哺乳動物中Hedgehog家族包括3個同系物：Shh、Indian hedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）[19]。Shh是Hedgehog家族中研究脊椎動物最好的配體，大部分有關Hedgehog信號通路的研究都是通過Shh實現的。Shh的信號通路受體由PTCH家族受體和SMO兩種膜蛋白及下游轉錄因子Gli構成，轉導主要是受相關細胞膜蛋白PTCH和SMO影響，受體PTCH由抑癌基因Patched編碼，而癌基因Smoothened則編碼著SMO受體[18]。Shh在胞漿內經過一系列反應后形成具有信號轉導功能的成熟肽，然后分泌到細胞外，并作為配體與其受體PTCH結合，解除其對中間信號分子SMO的抑制作用，活躍的SMO將Shh信號向細胞內傳遞，從而激活下游轉錄因子Gli。脊椎動物Gli家族包括Glil、Gli2及Gli3 3種蛋白，被激活后由細胞漿轉位至細胞核內，發揮轉錄因子作用[19]。

Shh與胃底腺功能的維持關系緊密，但高水平的Shh活化也意味著惡變的風險增加，可能會使細胞增殖不受控制。Berman等[20]發現，胃癌細胞系中存在高水平的Shh通路自發活化。Shh表達上調可引起Shh信號通路中PTCH至Gli1途徑的異常激活，并最終導致胃癌的發生。Lee等[21]的研究顯示，萎縮、IM和胃腺瘤中Shh都存在過度表達，在Hp感染相關的假幽門腺化生組織中，Shh也出現高表達，并以旁分泌的形式激活Gli在基質中的表達。此外，體內外實驗[22]都已顯示，Shh通路的拮抗劑環杷明（cyclopamine）特異性結合其中間信號分子SMO后，通過阻斷Shh的細胞反應，能夠抑制胃癌細胞株的生長，這也從側面反映出Shh信號通路在胃癌的發生、發展中所起的推進作用。

在本研究中，采用病證結合的造模方法進行證候動物模型的構架，通過胃組織HE染色結果及大鼠一般情況觀察可知本方法能較好地構建大鼠PLGC脾虛痰濕熱瘀證模型。結合既往相關動物模型構建的研究結果可知，以該方案進行PLGC動物模型構建，實驗結果較為穩定[14，23]。在后續藥物干預治療中，維酶素組和中藥各劑量組大鼠的胃黏膜病理均較模型組改善，病理結果顯示中藥中、高劑量組療效最佳，可知復方胃炎合劑對于PLGC的療效確切。對Shh信號通路的研究中發現，模型組大鼠存在Shh信號通路的表達異常，信號通路處于抑制狀態，與既往的研究[24-25]結果基本一致。加入復方胃炎合劑進行干預后，PLGC脾虛痰濕熱瘀證大鼠Shh信號通路關鍵因子SHH、SMO、PTCH、Gli1 mRNA表達上調，同時Gli2 mRNA表達出現相應下調，表明復方胃炎合劑可通過重新激活抑制狀態的Shh信號通路，改善PLGC大鼠的胃黏膜病理改變，抑制PLGC進展。

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