白花九里明對脂肪肝干預及肝臟結構和功能保護的研究

黃世宇，王彩冰，申璐，韋國賓，黃海峰，劉子豪，林娜

（1.河池市第一人民醫院，廣西 河池 546300；2.右江民族醫學院，廣西 百色 533000）

壯藥白花九里明[Blumea Megacephala（Randeria）]為菊科植物，民族藥物記載其在壯族民間常用于治療跌打腫痛、風濕骨痛、月經不調、產后流血等癥候[1-2]。脂肪肝已成為現代社會中最普遍的一種肝臟疾病，由于攝入過多脂肪妨礙機體的能量代謝和物質代謝，會引發身體多種疾病，如肝硬化、肥胖癥、高血壓、冠心病、動脈硬化等，嚴重危害人們的身體健康甚至生命安全[3-5]。近年來，有研究發現，白花九里明具有抑制心收縮力、增強小腸運動、保護肝臟、降低血壓、促凝止血、抗炎鎮痛等作用[6-11]。目前，針對白花九里明對高脂攝食和脂肪肝影響的相關研究國內外鮮有報道。基于此，本研究采用豬油給予小鼠灌胃[12]制造高脂攝食誘導脂肪肝模型，按白花九里明壯族民間口服用量和臨床降血脂藥物辛伐他丁用量換算為小鼠用量[1，13-14]，給予脂肪肝模型小鼠灌胃，檢測血脂、轉氨酶含量并分析肝組織結構，探討白花九里明對高脂誘導脂肪肝的干預保護作用，旨在為白花九里明的開發利用提供實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康KM 小鼠60 只，雌雄各30 只，體質量25～30 g，由右江民族醫學院動物實驗中心提供（實驗動物生產許可證：SCXK桂2017-0003，實驗動物使用許可證：SYXK桂2017-0004）。

1.2 藥材、藥品和儀器 白花九里明采自廣西百色市，曬干備用。辛伐他汀（浙江京新藥業股份有限公司，批準文號：A1811291）；0.9%氯化鈉注射液（廣西裕源藥業有限公司，批準文號：L18091604）；甲醛（煙臺市雙雙化工有限公司，批準文號：20180301）；TG測試盒、TP定量測試盒、ALT測試盒（南京建成生物工程研究所，批準文號：20190420、20190421、20190418）；多功能酶標儀（上壹橋國際貿易有限公司，型號：Tristar Lb941）；數碼顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司，型號：BA2100igital）；高速離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：TGL-16G）；電子天平（諸暨市超澤衡器設備有限公司，型號：JMB1003）；三用恒溫水箱（金壇市醫療儀器廠，型號：HH-W600）。

1.3 方法

1.3.1 白花九里明提取液制備 取白花九里明干草400 g，用30 ℃溫水4 000 mL浸泡4 h，文火煮沸1 h，16層紗布過濾，濾液隔水文火濃縮至400 mL，提取液濃度為1 g/mL，冷卻放冰箱4 ℃保存，用時雙蒸水配制成0.2、0.4、0.8 g/mL的白花九里明提取液。

1.3.2 豬油制備 于百色市東風市場購豬板油1 000 g，文火加熱提煉豬油586 g/578 mL，豬油密度為1.013 8 g/mL，冷卻放冰箱4 ℃保存，用時隔水加熱熔化。

1.3.3 動物分組與給藥方法 60 只小鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，辛伐他汀組，白花九里明低濃度組、白花九里明中濃度組和白花九里明高濃度組，每組10只。各組小鼠每天灌胃2次：正常對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，其他組給予1.013 8 g/mL豬油灌胃；正常對照組和模型對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，辛伐他汀組給予0.3 mg/mL辛伐他汀灌胃，白花九里明低濃度組、中濃度組、高濃度組分別給予0.2、0.4、0.8 g/mL白花九里明提取液灌胃；2次灌胃間隔20 min，灌胃量均按小鼠體質量計算（10 mL/kg），連續5周。

1.3.4 血清甘油三酯（TG）、總蛋白（TP）、谷丙轉氨酶（ALT）含量檢測 在末次灌胃后禁食12 h、禁水2 h 摘除眼球取血分離血清，分別用TG測試盒、TP定量測試盒、ALT測試盒，按說明書進行操作，用酶標儀檢測血清TG、TP、ALT含量。

1.3.5 肝組織切片觀察 分離肝右葉浸泡于10%甲醛固定液24 h，經脫水、石蠟包埋、HE染色法制成肝組織切片，通過數碼顯微鏡觀察肝組織結構并攝影。

1.4 觀察指標 比較各組小鼠血清TG、TP、ALT 指標；比較各組小鼠肝組織切片結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料以“”表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清TG、TP、ALT含量比較 模型對照組TG明顯高于其他各組（P＜0.05），白花九里明低濃度組、中濃度組TG明顯高于正常對照組（P＜0.05），白花九里明高濃度組TG明顯低于白花九里明低濃度組（P＜0.05），白花九里明高濃度組、辛伐他汀組、正常對照組TG組間兩兩比較差異無統計學意義；模型對照組、辛伐他汀組、正常對照組TP 組間兩兩比較差異無統計學意義。白花九里明低濃度組、中濃度組、高濃度組TP明顯高于辛伐他汀組（P＜0.05），白花九里明低濃度組TP 與正常對照組比較差異無統計學意義，白花九里明中濃度組、高濃度組TP 明顯高于正常對照組（P＜0.05），白花九里明中濃度組、高濃度組TP 組間比較差異無統計學意義；模型對照組ALT明顯高于正常對照組（P＜0.05），辛伐他汀組ALT與正常對照組比較差異無統計學意義，但明顯低于模型對照組（P＜0.05），白花九里明低濃度組、中濃度組、高濃度組ALT組間兩兩比較差異無統計學意義，但明顯低于正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組（P＜0.05），見表1。

表1 各組血清TG、TP、ALT含量比較（）Table 1 Comparison of serum TG,TP,ALT contents in each group()

表1 各組血清TG、TP、ALT含量比較（）Table 1 Comparison of serum TG,TP,ALT contents in each group()

注：TG，甘油三酯；TP，總蛋白；ALT，谷丙轉氨酶。與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型對照組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與辛伐他丁組比較，eP＜0.05，fP＜0.01；與白花九里明低濃度組比較，gP＜0.05

組別正常對照組（n=10）模型對照組（n=10）辛伐他丁組（n=10）白花九里明低濃度組（n=10）白花九里明中濃度組（n=10）白花九里明高濃度組（n=10）ALT（U/L）18.19±6.32 25.39±6.77a 17.94±6.94c 11.07±3.13bdf 10.13±5.70bdf 7.85±2.28bdf TG（mmol/L）1.37±0.20 2.25±0.40b 1.49±0.29d 1.80±0.45ac 1.68±0.23ad 1.44±0.24dg TP（g/L）104.11±23.00 114.65±20.32 100.81±23.73 125.03±27.92e 135.51±33.99bf 133.64±20.88af

2.2 各組小鼠肝組織切片結果比較 正常對照組肝細胞形態結構清晰正常、肝索排列規則、肝血竇清晰、中央靜脈管內僅見少許血細胞；模型對照組肝細胞數量明顯減少、體積及胞核明顯增大，肝細胞內出現大小不等的脂肪空泡并有些融合成大空泡呈現脂肪變性，肝索明顯紊亂，肝血竇少而小，中央靜脈管明顯充血；辛伐他汀組、白花九里明低濃度組的肝細胞數量無明顯減少、體積及胞核稍增大，肝細胞內脂肪空泡呈現脂肪變性程度明顯小于模型對照組，肝索排列紊亂，肝血竇明顯可見，中央靜脈管未見充血；白花九里明中濃度組、高濃度組肝細胞數量、體積和胞核與正常對照組比較無明顯差異，肝細胞內無明顯脂肪空泡，肝索排列較規則，肝血竇清晰，中央靜脈管不充血；白花九里明中濃度組結構形態比低濃度組更接近正常對照組；白花九里明高濃度組結構形態明顯與正常對照組相似，見圖1～2。

3 討論

脂肪在機體內的主要功能是儲存和供給能量，肝臟在脂肪的攝取、轉運、代謝中發揮重要作用，TG 是機體脂肪代謝的主要產物，肝細胞攝取TG 進行氧化分解同時釋放能量供機體利用，當機體攝取脂肪過多可使血中TG升高，臨床上將血中TG含量作為判斷高脂血癥的敏感指標；ALT為胞內酶存在于肝細胞內參與蛋白質合成，當肝細胞膜受損可使血中ALT 升高，臨床上檢測血中ALT 升高用于判斷肝功能損害及程度的敏感指標[5，15]。本研究用富含脂肪的豬油給小鼠灌胃制造高脂攝食誘導脂肪肝模型，探討白花九里明在脂肪肝模型中對肝臟的干預性保護作用。

圖1 各組小鼠肝組織切片HE染色結果（×100）Figure 1 HE staining results of liver tissue sections of mice in each group(×100)

圖2 各組小鼠肝組織切片HE染色結果（×400）Figure 2 HE staining results of liver tissue sections of mice in each group(×400)

本研究結果顯示，模型對照組血清TG、ALT 明顯高于正常對照組（P＜0.05）；正常對照組肝細胞形態結構清晰正常，肝索排列規則，肝血竇清晰，中央靜脈管內僅見少許血細胞；模型對照組肝細胞數量明顯減少、體積及胞核明顯增大，肝細胞內出現大小不一的脂肪空泡并部分融合成大空泡呈現脂肪變性，肝索明顯紊亂，肝血竇變少而模糊，中央靜脈管明顯充血。提示高脂攝食呈現高脂血癥、肝細胞脂肪變性、肝細胞膜受損；說明脂肪肝造模成功，高脂攝食可導致高脂血癥、脂肪肝，損害肝組織結構和功能。

本研究結果還顯示，辛伐他汀組血清TG、ALT 明顯低于模型對照組（P＜0.05），但與正常對照組比較差異無統計學意義，肝細胞數量無明顯減少、體積及胞核稍增大，肝細胞內脂肪空泡呈現脂肪變性程度明顯小于模型對照組，肝索排列紊亂，肝血竇明顯可見，中央靜脈管不充血。提示辛伐他汀能改善高脂攝食導致的高脂血癥、肝細胞脂肪變性、肝細胞膜受損。說明本研究所用的小鼠對降血脂藥物有正常反應，辛伐他汀有降血脂的作用，可減輕高脂對肝組織損傷并維持肝細胞膜完整性，對肝臟有一定的保護作用。

本研究結果還顯示，①白花九里明低濃度組、中濃度組、高濃度組血清TG明顯低于模型對照組（P＜0.05），白花九里明低濃度組、中濃度組TG 明顯高于正常對照組（P＜0.05），白花九里明中濃度組TG 與白花九里明低濃度組、高濃度組和辛伐他汀組比較差異無統計學意義，白花九里明高濃度組TG明顯低于白花九里明低濃度組（P＜0.05），但與正常對照組和辛伐他汀組比較差異無統計學意義。提示白花九里明能改善高脂攝食導致的高脂血癥，該作用存在量效正相關。②白花九里明中濃度組、高濃度組血清TP 明顯高于正常對照組（P＜0.05），白花九里明低濃度組、模型對照組、正常對照組血清TP 兩兩比較差異無統計學意義，白花九里明低濃度組、中濃度組、高濃度組血清TP 顯高于辛伐他汀組（P＜0.05）。提示白花九里明有提高血清蛋白含量的作用。③模型對照組血清ALT 明顯高于正常對照組（P＜0.05），白花九里明低濃度組、中濃度組、高濃度組血清ALT 明顯低于模型對照組和正常對照組（P＜0.05）。提示白花九里明可明顯降低血清ALT，肝細胞膜未受損。④白花九里明低濃度組肝細胞數量無明顯減少，體積及胞核稍增大，肝細胞內脂肪空泡呈現脂肪變性程度明顯小于模型對照組，肝索排列紊亂，肝血竇明顯可見，中央靜脈管不充血；白花九里明中濃度組、高濃度組肝細胞數量、體積和胞核與正常對照組比較無明顯差異，肝細胞內無明顯的脂肪空泡，肝索排列較規則，肝血竇清晰，中央靜脈管不充血；白花九里明中濃度組的結構形態比低濃度組更接近正常對照組；白花九里明高濃度組結構形態明顯與正常對照組相似。提示白花九里明可干預高脂攝食誘導的肝細胞脂肪變性，保護肝細胞正常形態和大小。上述結果說明白花九里明能降血脂，促進蛋白質合成，防止高脂對肝組織損傷，維護肝細胞正常形態、大小和功能，從而起到保護肝臟的作用，作用存在量效正相關。

綜上所述，高脂攝食可導致高脂血癥、脂肪肝、損害肝組織結構和功能；辛伐他汀能降血脂，減輕高脂對肝組織損傷；白花九里明能降血脂，促進蛋白質合成，防止脂肪肝形成，維護肝細胞膜完整性和肝細胞的形態、大小和功能，白花九里明中濃度、高濃度的護肝作用明顯優于辛伐他汀。脂肪肝是指肝細胞脂肪變性或壞死，肝細胞脂肪變性會導致線粒體功能受損，造成肝細胞對脂質代謝的能力降低，并引起機體過氧化反應和丙二醛（MDA）含量增多致使肝細胞損害。白花九里明可通過減少肝細胞MDA生成，阻斷肝細胞的脂質過氧化反應，具有護肝作用[3-5，8，16-17]；同時，本研究結果證實，白花九里明具有降血脂、防止脂肪肝、維護肝組織結構和功能作用。