基于網絡藥理學的瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的潛在機制研究

趙沛涵 曹鳳 陳昕力 陳丹 李思霆 王朝陽

摘要 目的：采用網絡藥理學方法探討瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的依據，預測瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的作用機制。方法：通過數據庫檢索，得到失眠、抑郁的疾病基因及瀉心通腑湯中活性成分的作用靶點;并篩選出瀉心通腑湯的中藥活性成分在治療失眠伴抑郁過程中所涉及的功能及通路，最終構建“中藥-活性成分-靶點-通路”網絡。結果：通過網絡藥理學方法得到瀉心通腑湯中50種活性成分可與失眠伴抑郁的191個疾病靶點相關聯，KEGG富集分析得到通路124條。結論：瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁可能是通過多靶點、多成分起到作用，而其中PI3K/AKT信號通路為瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁最有可能起作用的通路。

關鍵詞 瀉心通腑;失眠;抑郁;網絡藥理學;作用機制

Abstract Objective：To predict the mechanism of Xiexin Tongfu Decoction in the treatment of insomnia depression，the network pharmacology method is applied in the paper.Methods：By retrieving database search，the disease genes of insomnia and depression and the targets of the active ingredients in Xiexin Tongfu Decoction were obtained; and the functions and pathways involved in the treatment of insomnia and depression were screened out.And finally a “Chinese Medicinal-Active Ingredient-Target-Pathway” network was built.Results：The 50 active ingredients in Xiexin Tongfu Decoction can be associated with 191 disease targets of insomnia and depression through network pharmacology.KEGG enrichment analysis revealed 124 pathways.Conclusion：The treatment of insomnia with depression by Xiexin Tongfu Decoction may be through multiple targets and multiple components，and the PI3K/AKT signaling pathway is the most likely pathway for the treatment of insomnia with depression by Xiexin Tongfu Decoction.

Keywords Xiexin Tongfu; Insomnia; Depression; Network pharmacology; Mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.13.008

抑郁癥作為一種臨床常見的全球范圍發病率逐年上升的精神疾病，目前已成為全球疾病負擔的第三大貢獻[1]。失眠是以頻繁而持續的入睡困難或睡眠維持障礙，以致睡眠滿意度不足為特征的睡眠障礙[2]。目前研究表明，失眠與抑郁癥是同一病機在不同發展階段的2個方面，為異病同因，并可互相轉變[3]。

抑郁癥在中醫被歸為“郁證”“臟躁”“梅核氣”“百合病”的范疇，多因七情所傷，情志不遂，肝氣郁結導致肝失疏泄、脾失健運、心失所養、臟腑陰陽氣血失調。《素問·舉痛論》說：“思則心有所存，神有所歸，正氣留而不行，故氣結矣。”[4]失眠癥在傳統醫學中歸屬“不寐”“目不瞑”的范疇。《靈樞·口問篇》云：“陽氣盡，陰氣盛，則目暝;陰氣盡而陽氣盛，則寤矣。”[5]故不寐的病機為營衛失和，神魂失斂，病位主要在心。

瀉心通腑湯為王朝陽教授承襲《道德經》中“虛其心，實其腹”之思想、《黃帝內經》中“七損八益”所蘊含的瀉心益肝之理，以及《傷寒雜病論》中關于瀉心湯、陽旦湯、黃連阿膠湯的核心治法，通過脈證結合中醫氣化結構理論自擬的治療失眠伴抑郁的中藥復方，核心組成為半夏、柴胡、黃連、黃芩、干姜。瀉心通腑湯以瀉其心，降其胃，和其膽，交心腎為治法，旨在“虛其心，實其腹，弱其志，強其骨”。

本研究旨在探析瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的中藥物質基礎和可能的作用機制，借助網絡藥理學技術，根據“中藥-活性成分-靶點-通路”間的關系探究該方治療失眠伴抑郁的活性成分、相關靶點和影響到的通路共同作用機制，以期為后續的研究工作提供證據和基礎。

1 資料與方法

1.1 篩選瀉心通腑湯活性成分和相關靶點 以瀉心通腑湯中所含5味中藥的化學成分為檢索詞，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫檢索，以口服利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%并且類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為標準篩選出瀉心通腑湯活性化合物成分。通過SymMap（https：//www.symmap.org/）數據庫收集5味藥物中成分分別所對應的靶點。

1.2 篩選失眠伴抑郁相關靶點 以“Depression”“Sleep Initiation and Maintenance Disorders”作為關鍵詞在比較毒物遺傳學數據庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org/）中檢索、篩查失眠伴抑郁相關靶點，整合出疾病靶點數據庫。

1.3 構建瀉心通腑湯化合物-靶點網絡關系 將藥物和疾病的交集靶點上傳至STRING（https：//string-db.org/）數據庫，可獲得瀉心通腑湯和失眠伴抑郁之間的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）關系，利用Cytoscape 3.7.2軟件（http：//www.cytoscape.org/）生成化合物-靶點相互作用的網絡圖并進行拓撲參數分析，以介度、緊密度以及連接度的中位數為標準來確定化合物-靶點網絡核心靶點。

1.4 構建PPI網絡并篩選關鍵靶點 將所得靶點上傳至STRING數據庫，進行蛋白質-蛋白質相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）分析。將研究物種設置為“Homo Sapiens”（人）、最低互作評分設置為0.40;再將最低互作評分設置為0.99，其余參數保持默認設置，得到瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的核心PPI網絡關系。選用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Network Analyzer”對PPI網絡進行拓撲分析，將結果中自由度（Degree）、介度（Betweenness）和中心性（Closeness）都大于平均值的靶點作為所有靶點中的關鍵靶點。

1.5 KEGG富集分析 將以上檢索得到的基因導入DAVID數據庫（https：//david.ncifrcf.gov/），物種選擇“Homo Sapiens”（人），對瀉心通腑湯和失眠伴抑郁的共同作用靶點蛋白做京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，篩選出P<0.05的瀉心通腑湯和失眠伴抑郁共同靶點所富集的信號通路。

1.6 構建瀉心通腑湯“中藥-活性成分-靶點-通路”網絡 篩選KEGG富集分析中排名前20且不屬于特異性疾病通路的通路，與靶標互作網絡中的靶標進行匹配，并將中藥、活性成分、通路、靶標分別上傳至Cytoscape 3.7.2軟件中，構建瀉心通腑湯“中藥-活性成分-靶點-通路”網絡圖。

2 結果

2.1 瀉心通腑湯活性成分及靶點篩選結果 在TCMSP數據庫中設定OB與DL值，剔除在SymMap數據庫中無靶點對應的成分，最終獲得有效成分為黃連10個，黃芩21個，柴胡9個，半夏11個，干姜5個，共56個有效成分，剔除重復值后得到共50個活性成分，200個相關靶點。見表1～2。

2.2 失眠伴抑郁靶點檢索結果 CTD數據庫中可檢索到失眠、抑郁靶點432個，取得疾病與瀉心通腑湯的交集靶點191個。

2.3 瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的核心靶點分析結果 選用STRING數據庫，分析瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁靶點之間的交集基因，選擇數據庫中“Homo Sapiens”（人）物種，做所得191個靶點的PPI關系圖。將所得靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件進行PPI網絡拓撲分析，選用Cytoscape 3.7.2軟件中“Network Analyzer”，定義關鍵靶點為自由度（Degree）、介度（Betweenness）和中心性（Closeness）均大于平均值的靶點，根據Degree值降序排列得到核心靶點AKT1。見表3。靶點蛋白及其互作關系見圖1，關鍵靶點之間的關系見圖2。

2.4 KEGG信號通路分析結果 瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁共涉及191個相關靶點，將其導入DAVID數據庫進行KEGG富集分析得到124條通路，其中P<0.05的通路有37條，說明瀉心通腑湯可能通過這些通路起到治療失眠伴抑郁的作用。見圖3。

2.5 構建瀉心通腑湯“中藥-活性成分-靶點-通路”網絡圖 篩選出富集分析中排名前20且不屬于特異性疾病通路的通路，將中藥、活性成分、靶點、通路分別上傳至Cytoscape 3.7.2軟件中，將4者進行匹配，構建“中藥-活性成分-靶點-通路”網絡圖。見圖4。

3 討論

瀉心通腑湯具有瀉其心，降其胃，和其膽，交心腎之效，王朝陽教授臨床選用該方治療失眠伴抑郁具有確切的效果。本研究借助網絡藥理學方法，構建瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁“中藥-活性成分-靶點-通路”的綜合網絡，以期系統性揭示其物質基礎及其分子機制。

3.1 瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的活性成分分析

數據挖掘、整理篩查后獲得瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的活性化學成分總計為80個（表2）。復方藥物的活性成分所對應的靶點由高到低分別為：黃連中的成分槲皮素（Quercetin）、柴胡中的成分山柰酚（Kaempferol）、黃芩中的成分漢黃芩素（Acacetin）、柴胡中的成分異鼠李素（Isorhamnetin）、黃芩中的成分金合歡素（Wogonin）和半夏中的成分卡文定堿（Cavidine），可以推斷以上成分在瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁中可能起到關鍵作用。相較而言，干姜所包含的靶點相對較少，說明其成分在瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁中特異性作用較低。槲皮素作為一種天然的多羥基黃酮化合物，具有保護神經、抗炎、抗衰老等多方面作用。在治療精神疾病方面，槲皮素主要通過改善脂質代謝和海馬、前額葉皮層突觸相關蛋白，調節下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal，HPA）軸活性，緩解焦慮、抑郁、認知低下的狀態進而改善精神行為[6-7]。研究發現，作為一種黃酮醇類化合物，山柰酚能抑制神經元細胞凋亡、促進神經細胞再生，調控和激活與抑郁癥相關的信號通路，延緩神經退行性疾病的發展，提高抑郁癥模型小鼠的認知能力[8-9]。此外，在免疫方面，山柰酚則是通過抑制大鼠神經炎癥發生的方式抑制海馬體中IL-1β、TNF-α和NO的表達[10]。漢黃芩素在人體內可轉化為黃芩苷和漢黃芩苷，通過發揮鎮靜催眠、安神定驚等作用治療失眠[11]。金合歡素為天然黃酮類化合物，能通過減少神經細胞的凋亡、炎癥介質的分泌，抑制海馬突觸體中谷氨酸的釋放，有效地避免紅藻氨酸（Kainic Acid，KA）誘導的興奮毒性，起到神經保護作用[12]。

3.2 瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的關鍵靶點分析 基于Cytoscape軟件對PPI網絡進行拓撲分析，得到AKT1、TP53、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3、TNF、JUN等20個關鍵靶點，提示瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁可能是作用于這些靶點進而發揮其治療作用。AKT1作為其中的核心靶點，其靶蛋白活性直接能夠影響抑郁程度。AKT1主要通過強化海馬干細胞的活性和提高抗抑郁藥物療效，影響其下游底物的絲氨酸和（或）蘇氨酸磷酸化進而調節抑郁癥的許多進程[13]。瀉心通腑湯可能是通過對促炎細胞因子的抑制作用降低人體內TNF-α的分泌水平和活性，以實現抗抑郁作用[14-15]。此外，以腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）為代表的靶點可調節睡眠、促進膠質細胞生長和大腦發育影響人體的炎癥反應和免疫功能，干預失眠伴抑郁的進程[16]。IL-6和TNF作為官方的睡眠調節物質、重要的炎癥介質，失眠和抑郁能夠影響人體炎癥反應和全身免疫功能，改變人體血清IL-6和TNF水平，造成IL-6和TNF的升高[17]。血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）作為一種主要的促血管新生因子，普遍分布于神經系統，能夠特異地作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子，調控血管內皮細胞的增殖分化、血管形成等許多生理和病理情況，在抑郁癥的治療中發揮重要的作用;動物實驗中有證據表明，抑郁大鼠抗抑郁藥物治療后VEGF的表達增加[18-19]。

PPI網絡結果顯示，瀉心通腑湯的靶蛋白之間存在著復雜的相互關系，能夠對多種過程、分子及通路產生影響。中藥-活性成分-靶點-通路圖顯示出瀉心通腑湯抗失眠伴抑郁作用是由多重成分、靶點、通路共同起效的結果。

3.3 瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的通路結果分析

KEGG分析可知，PI3K/AKT信號通路為瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁最有可能起作用的通路，其作用機制可能是抑郁引起PI3K和AKT的mRNA含量增加，進一步促使基因表達，啟動PI3K/AKT信號通路，使PI3K、AKT蛋白含量增加，經過一系列復雜的級聯反應后，促使人體血清中參與睡眠進程的免疫調節因子IL-6、TNF持續性大劑量升高，參與血管新生的VEGFA細胞因子升高，進而干預治療失眠伴抑郁的過程[20-22]。PI3K下游的核心靶標AKT1對抑郁患者的嚴重程度、焦慮狀態產生影響;GSK-3β多態性影響抑郁癥發病;GSK-3β、mTOR與抗抑郁藥物的起效速度關系密切[23]。

PI3k/AKT/NF-κB信號通路過度激活與抑郁的發生和發展密切相關;調節過度激活的海馬核因子κB信號通路或利用藥物抑制核因子κB的過度激活，可減輕抑郁模型動物的抑郁行為[24]。

PI3K/AKT/FoXO信號通路在精神疾病中逐漸引起重視，該通路通過影響下游多種靶點、靶蛋白的活化狀態以促進細胞成活、抑制細胞凋亡進而起到腦保護作用;而抗抑郁藥物很有可能是通過PI3K/AKT/FoxO信號通路發揮神經保護作用，進而實現抗凋亡作用[25]。

本研究采用網絡藥理學的方法對瀉心通腑湯治療失眠伴抑郁的機制及可能發揮作用的通路進行探討和預測，為進一步尋找瀉心通腑湯的有效成分和作用通路奠定理論基礎。瀉心通腑湯作為一個中藥復方，其活性成分能夠通過多個靶點、多條通路對失眠伴抑郁進程整體調控。本研究得出瀉心通腑湯可以從以下方面發揮治療失眠伴抑郁的作用：1）作用于AKT1靶點，提高其蛋白活性促進抗抑郁藥物起效。2）調節BDNF、谷氨酸、IL-6、TNF等炎癥介質的表達。3）調節PI3K/AKT通路，促進神經營養因子釋放、腦血管新生，抑制谷氨酸能系統功能，抑制海馬神經元凋亡，抑制抑郁癥神經炎癥的發生，輔助抗抑郁藥物快速起效。4）影響PI3K/AKT下游的核因子κB信號通路、FoXO信號通路，抑制核因子κB的過度激活、抑制細胞凋亡，發揮腦保護作用。

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（2020-01-12收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）