蒙藥斯日西散質量標準研究

敖登其木格 王海榮 烏漢其木格 錫林其其格 特格喜白音 阿拉騰其木格

摘要 目的：建立蒙藥斯日西散的質量標準。方法：用顯微和薄層色譜法對斯日西散中的大黃、土木香、寒水石、山柰、木鱉子、石榴、黑冰片進行顯微鑒別，對大黃、山柰、土木香進行薄層色譜鑒別;用高效液相色譜法測定大黃中大黃素的含量。結果：斯日西散顯微鑒別特征圖片清晰，薄層鑒別在大黃、山柰、土木香對照品斑點對應的位置具有相同顏色的清晰斑點，陰性無干擾。大黃素在0.001 7～0.135 2 mg/mL范圍內與峰面積的線性關系良好（r=0.999 8），平均回收率為102.15%，平均含量為0.105 5 mg/g。結論：該方法全面、簡便、準確，為斯日西散質量控制提供可靠標準。

關鍵詞 斯日西散;顯微鑒別;薄層鑒別;高效液相色譜

Abstract Objective：To improve the quality standard of Mongolian medicine sirixi.Methods：Microscopic and TLC identification method was used to distinguish Radix et Rhizoma Rhei，Radix Inulae，Han Shuishi，Rhizoma Kaempferiae，Semen Momordicae，Shiliu，Hei Bingpian in Mongolian medicine sirixi for microscopy and thin layer chromatography.Emodin in Rad ix et Rhizoma Rhei was determined by High Performance Liquid Chromatography.Results：The microscopic identification feature pictures of Sirixis were clear，and the thin-layer identification had clear spots of the same color at the positions corresponding to the spots of Radix et Rhizoma Rhei，Radix Inulae，and Rhizoma Kaempferiae reference substances，negative and no interference.Emodin has a good linear relationship with the peak area in the range of 0.001 7 to 0.135 2 mg/mL （r=0.999 8），the average recovery rate was 102.15%，and the average content was 0.105 5 mg/g.Conclusion：The method can be used to distinguish Mongolian medicine sirixi for its quality control.

Keywords Mongolian medicine sirixi; Microscopic identification; TLC identification; High performance liquid chromatography

中圖分類號：R29;R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.005

蒙藥斯日西散是傳統蒙醫藥中的一個經典藥物，有著上千年的歷史，該藥由訶子、木鱉子、五靈脂、堿面、石榴、黑冰片、寒水石、大黃、土木香、山柰等十味藥材組成，其功效主治為祛“寶日”病，“寶日”病，初、中期暖氣吞酸、胸背作痛，氣滯血瘀，血熱陷中，潛伏于臟等病癥。臨床主要用于胃腸積熱、食不消、返酸、腹脹、肝膽“希日”、便秘[1-2]。雖然斯日西散劑臨床應用非常廣泛，但是至今沒有確切的質量標準，故本研究中對斯日西散劑進行顯微鑒別及薄層鑒別，并采用高效液相色譜法對大黃中大黃素的含量進行控制，為建立斯日西散劑的質量控制方法提供有效依據，以全面提升該制劑的質量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平（Sartorius，德國，型號：BT25S、BSA423S）;暗箱三用紫外線分析儀（上海嘉鵬科技，型號：ZF-7）;數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500DE）;電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器，型號：DHG-9240A）;超純水儀（默克，德國，Milli-Q Advatage A10）倒置熒光顯微鏡（尼康株式會社，日本，型號：Ti-U）;高效液相色譜儀（Thermo，美國，型號：ultimate3000）。薄層板為0.25%硝酸銀溶液制備的自制硅膠G薄層板、預制硅膠H板（青島海洋化工廠分廠，型號：100 mm×200 mm）、預制硅膠GF254板（青島海洋化工廠，型號：100 mm×200 mm）;

1.2 試劑 甲醇（Fisher色譜溶劑，貨號：A452-4）、乙腈（Fisher色譜溶劑，貨號：A998-4）為色譜純，甲醇（天津市致遠化學試劑有限公司，生產批號：20160613）、鹽酸（北京化工廠，生產批號：20120818）、乙醚（天津市福晨化學試劑有限公司，生產批號：20160601）、三氯甲烷（天津市福晨化學試劑有限公司，生產批號：20160218）石油醚（天津市福晨化學試劑有限公司，生產批號：20160601），甲酸（天津市福晨化學試劑有限公司，生產批號：20160409）均為分析純試劑，水為離子交換高純水。

1.3 分析樣品 斯日西散（內蒙古自治區國際蒙醫醫院制劑中心，生產批號：20170118、20150629、20170701）;斯日西散模擬樣品（實驗室自制）;山柰對照藥材（生產批號：121504-201203）、對甲氧基桂皮酸乙酯對照品（生產批號：110835-201202）、大黃對照藥材（生產批號：120984-201202）、大黃酸對照品（生產批號：110757-200206）、大黃素對照品（生產批號：110756-201512）、土木香內酯對照品（生產批號：110760-201209）、異土木香內酯對照品（生產批號：110761-200204）均購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 依據2015版《中華人民共和國藥典》附錄中的顯微鑒別方法，采用粉末制片法。具體步驟如下，載玻片上滴加少量水合氯醛試液，再取少許斯日西散粉末攪拌均勻后酒精燈上微微加熱，見粉末顏色變淺、組織透明后滴加少量甘油，加蓋玻片，顯微鏡觀察。處方中具有專屬性、鏡檢率高的藥味顯微特征歸屬如下：1）石榴石細胞，呈類圓形或長卵形;2）黑冰片，黑色、呈不規則碎塊狀;3）山柰淀粉粒，淀粉粒眾多，單粒類圓形或三角形，多數扁平，臍點、層紋不明顯;4）土木香，網狀導管直徑30～100 μm;5）大黃草酸鈣簇晶，草酸鈣簇晶大，直徑20～160 μm;6）寒水石晶體團塊不規則形，大小不等，近透明;7）木鱉子子葉薄壁細胞，子葉薄壁細胞多角形，內含脂肪油滴及糊粒粉。見圖1。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 斯日西散中大黃的薄層鑒別 稱取1 g斯日西散，加20 mL甲醇溶液浸泡1 h后濾過，取5 mL濾液蒸干，加10 mL水溶解殘渣，再加1 mL鹽酸溶液，加熱回流30 min后立即冷卻，20 mL乙醚提取兩次，合并乙醚提取液，蒸干，加1 mL三氯甲烷溶解殘渣，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。按處方比例折算，相同工藝制備的模擬樣品與陰性對照（缺大黃）各1 g，用相同方法制備模擬樣品溶液以及陰性對照溶液。以大黃對照藥材和大黃酸對照品為對照進行薄層色譜法（通則0502）實驗，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，紫外光燈（365 nm）和日光下分別檢視。結果顯示大黃薄層鑒別分離效果好，被檢成分斑點清晰，斯日西散色譜中在與大黃酸對照品相應的位置（Rf值0.48）上顯橙黃色的熒光斑點，并且在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同的5個橙黃色熒光斑點，而陰性對照（缺大黃）色譜中在相應的位置上未出現相同的熒光斑點，表明處方中其他組分對大黃鑒別無干擾，具有專屬性。見圖2。3批供試品和模擬樣品薄層色譜結果見圖3。

2.2.2 斯日西散中山柰的薄層鑒別 取本品內容物3 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過，過濾作為供試品溶液。另取對甲氧基肉桂酸乙酯對照品，加甲醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例折算，分別取相同工藝制備的模擬樣品與陰性對照（缺山柰）各3 g，同法制備模擬樣品溶液以及陰性對照溶液。另取適量山柰對照藥材，同法制成對照藥材溶液。以山柰對照藥材和對甲氧基肉桂酸乙酯對照品為對照進行薄層色譜實驗，結果供試品與模擬樣品色譜中，在與對照品和對照品藥材色譜相應的位置上顯相同的熒光斑點（Rf值0.24），且同工藝同法制備的陰性對照（缺山柰）色譜中在相應的位置上未出現熒光斑點，表明處方中其他組分無干擾，具有專屬性。見圖4。3批供試品和模擬樣品薄層色譜結果見圖5。

2.2.3 斯日西散中土木香的薄層鑒別 取本品粉末5 g，加乙醚30 mL，振搖10 min，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚，加乙酸乙酯20 mL，置水浴上加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，加2 mL無水乙醇溶解殘渣，作為供試品溶液。另取土木香內酯對照品與異土木香內酯對照品制備對照品溶液。按處方比例折算，相同工藝制備的模擬樣品與陰性對照（缺土木香）各5 g，同法制備模擬樣品溶液以及陰性對照溶液。以土木香內酯和異土木香內酯為對照進行薄層色譜實驗，結果斯日西散與模擬樣品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同的斑點（Rf值：土木香內酯0.63，異土木香內酯0.54），而陰性對照（缺土木香）色譜中在相應的位置上未出現斑點，表明斯日西散處方中其他組分無干擾，具有專屬性。見圖6。3批供試品和模擬樣品薄層色譜結果見圖7。

2.3 含量測定

2.3.1 液相色譜條件 通過系統適應性考察，確定液相實驗色譜條件，色譜柱：C18柱（Thermo scientific，250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（42∶23∶35）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：254 nm;進樣量：10 μL;理論塔板數：結合2015年版《中華人民共和國藥典》一部“大黃”含量測定項下要求，本標準規定理論板數按大黃素峰計算應不低于3 000。

2.3.2 溶液制備 對照品溶液的制備：精密稱取大黃素對照品0.003 38 g，加25 mL甲醇溶液制成每1 mL含0.135 2 mg的溶液，即得。供試品溶液的制備：取本品約4.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定質量，分別超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，再稱定重量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.3 專屬性實驗 按斯日西散處方工藝制備不含大黃的陰性對照品，根據供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液（缺大黃）。精密吸取供試品溶液、大黃素對照品溶液與陰性對照溶液各10 μL注入液相色譜儀，按2.3.1的液相色譜條件測定。從圖8可見，供試品色譜中在與對照品色譜保留時間相同的位置上有色譜峰出現，而陰性對照在與大黃素對照品色譜保留時間相同的位置上無色譜峰出現，表明該含量測定方法陰性無干擾，專屬性好。

2.3.4 線性關系的考察 取大黃素對照品0.003 38 g，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻配制母液。精密吸取母液，稀釋2.5倍后再依次倍比稀釋，制備濃度梯度的稀釋液，吸入10 μL至液相色譜儀，按2.3.1液相色譜條件測定，以峰面積對大黃素量進行回歸分析，結果大黃素在0.001 7～0.135 2 mg/mL范圍內分別呈良好的線性關系。回歸方程為：y=0.684 4x-0.735 8，r=0.999 8，標準曲線數值見表1。

2.3.5 精密度試驗 精密稱取約4.5 g同一批號斯日西散（生產批號：20170118）6份，分別按上述供試品溶液的制備方法制備，按2.3.1色譜條件進行測定，進樣量各10 μL，計算大黃素峰面積的RSD為0.70%，符合2015版《中華人民共和國藥典》一部要求，精密度良好。見表2。

2.3.6 準確度試驗 取同一供試品（生產批號：20170118，含量0.050 6 mg/g）6份，各約2.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入大黃素對照品溶液2 mL（大黃素濃度為0.054 4 mg/mL），再分別精密加甲醇23 mL，按上述方法測定，實驗結果表明：回收率在85%～110%之間，準確度符合要求。見表3。

2.3.7 穩定性試驗 取同一供試品（生產批號：20170118），按上述供試品溶液的制備方法和色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進行測定。見表4。從表中數據可見，在24 h內游離大黃素峰面積值基本穩定不變。

2.3.8 樣品含量測定 取供試品3批（生產批號：20170118、20150629、20170701），按“2.3.2”方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項色譜條件對大黃素的含量進行測定（n=3），3批樣品中大黃素的含量結果見表5。

2.3.9 耐用性實驗 將柱溫從25 ℃調到35 ℃，其他按正文的色譜條件，取2.3.5精密度測定實驗中的樣品進行測定，進樣量為10 μL。見表6。實驗結果表明，該方法耐用性良好。

3 討論

斯日西是由治療肝胃郁熱型、肝胃不和型癥候的阿拉坦-5與具有和胃健脾、導滯消積、行血止痛之功效的阿木日-6組成的制劑。有報道稱，斯日西散聯合腸內營養混懸液應用于膿毒癥患者，可以極大程度上彌補單純腸內營養液所導致的胃腸道并發癥，并對胃腸道具有很好的保護作用[2]。同時其他臨床研究也表明，阿拉坦-5對慢性胃炎、消化道潰瘍、功能性消化不良等胃腸道疾病具有較明顯的治療作用[3-5]。而蒙藥阿木日-6散，即2015版《中華人民共和國藥典》記載的六味安消散，目前其臨床應用也越來越廣泛，有研究者總結阿木日-6散的臨床應用，常用于便秘、功能性消化不良、胃脘痛、胃食管反流等[6]。

然而關于斯日西散質量標準的研究卻不多。因此本研究首先對斯日西散中所含藥材的顯微和薄層鑒別進行了研究，因本制劑是以原藥粉制成的散劑，故對大黃、土木香、寒水石、山柰、木鱉子、石榴、黑冰片進行了顯微鑒別研究，結果顯示顯微鑒別特征圖片清晰，可作為以上藥材的鑒別依據;同時對組方中主要藥味大黃、山柰、土木香進行了薄層鑒別研究，大黃為處方中主要藥味之一，在處方中所占比例也較大，具有瀉熱通腸、涼血解毒的作用，參照2015版《中華人民共和國藥典》一部“大黃”項下的薄層鑒別方法，以大黃對照藥材和大黃酸為對照品進行條件摸索，確定方法并考察了室溫22 ℃（相對濕度20%）和低溫6 ℃、低濕（相對濕度35%）對薄層鑒別的影響，結果顯示低溫、低濕條件對整體分離效果無太大影響，耐用性良好，可用于該藥質量標準。山柰具有行氣溫中、消食、止痛等功效，為處方中主要藥味之一，本研究參照2015版《中華人民共和國藥典》一部山柰項下的薄層鑒別方法，以山柰對照藥材和對甲氧基桂皮酸乙酯為對照進行條件摸索，并對上述鑒別項進行了方法驗證，專屬性及耐用性考察試驗。土木香具有健脾和胃等功效，為處方中主要藥味之一，參照2015版《中華人民共和國藥典》一部“土木香”項下的薄層鑒別方法試驗的結果效果不好，無法鑒別。故參照2007版《內蒙古蒙藥制劑規范》記載的阿拉坦-阿木日膠囊鑒別土木香項下的薄層鑒別方法，以土木香內酯和異土木香內酯為對照進行條件摸索，同樣對上述鑒別項進行了方法驗證，專屬性及耐用性考察試驗。

本研究對斯日西散中游離大黃素的含量測定進行了實驗條件摸索，經分析方法驗證，該方法重現性好，專屬性強，方法中其他成分對大黃素測定無干擾，可用于該藥質量標準。方法學驗證過程當中，對25 ℃和30 ℃柱溫進行了比較，結果大黃素保留時間略有差異，但分離度及理論板數沒有變化，故本實驗研究采用柱溫25 ℃。而對檢測波長的選擇時，利用DAD檢測器自190～400 nm做光譜掃描，結果大黃素在221～288 nm處有吸收峰，結合《中華人民共和國藥典》2015年版一部“大黃”項下選擇254 nm作為檢測波長。對于斯日西散的提取方法，參照《中華人民共和國藥典》2015年版一部“六味安消散”含量測定項下游離大黃素的供試品溶液的制備方法，并對提取效率進行了考察，結果顯示超聲時間45 min時，游離大黃素含量最高，故確定超聲時間為45 min。同時也對峰純度進行了考察，以二極管陣列檢測對被測成分大黃素的峰進行純度驗證，大黃素峰匹配值為994，大于980，證明為單一組分。

本研究對斯日西散中的大黃、土木香、寒水石、山柰、木鱉子、石榴、黑冰片進行顯微鑒別，對大黃、山柰、土木香進行薄層色譜鑒別;用高效液相色譜法測定大黃中大黃素的含量，為建立斯日西散質量標準提供了重要依據，將對進一步挖掘和開發該藥有重要意義。

綜上所述，本研究中大黃、山柰、土木香薄層鑒別用料少，操作簡便，耐用性良好，專屬性強，可用于該藥質量標準。

參考文獻

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（2019-06-26收稿 責任編輯：王明）