核酸檢測用PCR儀設計和測試方法

鄭鎮欽

摘要：核酸檢測用PCR儀通過對未知模板進行定量分析，具有操作簡便、快速高效、特異性強、靈敏度高等優點，該技術在核酸定量分析和分子診斷等醫學領域應用十分廣泛。本文重要介紹PCR儀的設計和測試方法。

關鍵詞：PCR、設計方法、測試方法

一、熒光PCR工作站應用領域

分子生物學研究：對傳染性疾病進行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測，比如新型新型冠狀病毒SARS-CoV-2導致的新冠肺炎（COVID-19）的檢測等。

醫學領域研究：采用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。

二、熒光PCR工作站的基本原理

熒光共振能量轉移原理是當一個熒光分子（供體分子）的熒光光譜與另一個熒光分子（受體分子）的激發光譜重疊時，供體熒光分子自身的熒光強度衰減，受體熒光分子的熒光強度增強。Ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。Ct值是實時熒光PCR中一個很關鍵的因素，C代表循環（Cycle），t代表閾值（Threshold）。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可做出標準曲線。

實時熒光PCR工作站是基于熒光PCR技術的全自動化一體化儀器，設計的核心是PCR模塊。

三、PCR模塊的功能設計

1.高速升降溫度功能：通過快速升降溫完成聚合酶連鎖反應;

2.熒光讀取功能：在PCR過程中實現對熒光信號的讀取;

3.通信功能：模塊提供下位機軟件、電路接口，實現外部軟件對模塊的控制、數據讀取。

四、PCR管的選擇

由于PCR的核心指標是升溫速率、降溫速率、模塊溫度均勻性等，因此，PCR管容積越小，越有利于升降溫。盡管目前主要使用的PCR管有0.2mL透明單管、0.1mL透明單管、0.2mL透明八聯管、0.2mL白色八聯管、0.1mL透明八聯管、0.1mL白色八聯管等等，但我們仍然主張要進一步越小容積方向發展，應以微升級為目標，例如先進一步縮小至70μL。同時，為更有利于熒光掃描，PCR應盡量選用透明度高的材質。

五、PCR模塊的結構和設計

PCR模塊的每一個單元，應采用獨立的升降溫組件，每個升降溫組件可容納1個PCR管，PCR管可以是6聯管或者8聯管，或者其他規格。升降溫組件采用帕爾貼進行溫度控制，散熱采用水冷方式，帕爾貼加水冷散熱的組合方式使得PCR反應速度更快、溫度控制更精準。

主要組件有：

升降溫組件：每個組件搭載3個帕爾貼，可對模塊進行精確控溫以及快速升降溫;

水冷組件：采用水冷泵供給制冷液，可快速對帕爾貼進行降溫散熱，加快PCR反應速率;

運動組件：帶動掃描頭組件運動，快速對PCR管進行側掃描;

掃描頭組件：對PCR管進行掃描，檢測PCR管內熒光信號值;

加熱模塊壓緊件：壓緊模塊，使模塊與帕爾貼充分貼合，增強熱傳導速率。壓緊件采用聚醚醚酮材料加工;

加熱模塊：承載PCR管，同時為PCR管均勻傳導熱能。加熱模塊采用6063材料加工;

溫度保險：為升降溫組件提供溫度保護。溫度保險采用130℃、3A熔斷式溫度保險，可保證儀器安全;

帕爾貼：進行升降溫控制。每個加熱模塊下布置1-3個帕爾貼，使得加熱速度更快，均一性更好。

水冷組件：由水冷倉組件、水冷排組件、水冷泵組件和水冷管路組成。

六、PCR性能的測試方法

1.平均升溫速率的測試方法

獲得45℃（恒溫2min）->95℃（恒溫2min）循環的一組數據。取50℃±0.5℃范圍內一溫度點，溫度記為Ta，取90℃±0.5℃范圍內一溫度點，溫度記為Tb，從Ta到達Tb的時間記為t。按公式計算平均升溫速率：平均升溫速率=（Tb-Ta）/t。平均升溫速率溫度從50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃，平均升溫速率應≥1.5℃/s。

2.最大升溫升溫速率的測試方法

設置溫度采集時間間隔為Δt，Δt≤1s并盡可能足夠小，掃描溫度從50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃過過程中的瞬時最大溫度變化ΔTmax。按如下公式計算最大升溫速率：最大升溫速率=ΔTmax/Δt。溫度從50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃，最大升溫速率應≥2.5℃/s。

平均降溫速率和最大降溫速率同理測試。

3.控溫精度

獲得55℃（恒溫2min）->72℃（恒溫2min）->95℃（恒溫2min），且循環5次的溫度數據。取55℃、72℃、95℃三個溫度點，當測試溫度到達設定溫度后恒溫10s后（即當溫度穩定后），計時30s。記錄30s內的最高溫度和最低溫度，計算二者差值的一半ΔTn（n為5個循環），并取ΔTn的最大值Max（ΔTn）。Max（ΔTn）應≤0.5℃。

4.溫度準確度

獲得55℃（恒溫2min）->72℃（恒溫2min）->95℃（恒溫2min），且循環5次的溫度數據。取55℃、72℃、95℃三個溫度點，當測試溫度到達設定溫度后恒溫10s后（即當溫度穩定后），計時60s，每10s記錄一次溫度數據，即60s內共記錄6個溫度數據Ti（i=1～6），求Ti的平均值Tm。Tm與設定溫度差值的絕對值應≤0.5℃。

5.溫度均勻性

獲得55℃（恒溫2min）->72℃（恒溫2min）->95℃（恒溫2min），且循環5次的溫度數據。取55℃、72℃、95℃三個溫度點，當測試溫度到達設定溫度后恒溫10s后（即當溫度穩定后），計時60s，記錄溫度數據Ti（Ti=1，2，…n），在模塊上隨機或均勻選取n（n≥6）個孔位，取Ti最大與最小值，計算各孔位的溫度差值ΔT。各孔位（孔位需≥6）的溫度差值ΔT應在±1℃范圍內。

6.溫度持續時間準確度

以95℃±0.5℃為計時參考點，自顯示溫度首次到達計時參考點，計時開始;至末次到達計時參考點結束，記錄時間為tn（n=1～5，為循環數），并計算5個循環記錄時間的平均值tm。按下列公式計算相對偏差：相對偏差=（tm-t）/tx100%。

總結：聚合酶鏈式反應（PCR）是分子生物學里程碑式的巨大成就，而熒光定量PCR的發展，又具有飛躍式的巨大進步。因此，基于熒光定量PCR工作站的PCR設計和測試技術研究，是對人類生命健康具有重要意義的研究方向。

參考文獻：

[1]凱普企業工業設計中心熒光PCR工作站項目