百里香醌調控Caspase-3/Bax/Bcl-2信號通路誘導人皮膚鱗狀細胞癌增殖和凋亡的作用機制研究

周曉謙 金星姬 楊竹生 楊秀敏

[摘要]目的：探討百里香醌對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖、凋亡的影響及可能機制。方法：將A431細胞分為對照組，低、中、高濃度實驗組，對照組采用DMEM培養，而低、中、高濃度實驗組分別采用含1、15、30μg/ml百里香醌的DMEM培養。MTT法檢A431細胞增殖;臺盼藍法觀察A431細胞存活;劃痕試驗檢測各組A431細胞遷移;免疫熒光法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達;Westernblot檢測各組A431細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達。結果：百里香醌能有效抑制人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖，且呈濃度及時間依賴性;臺盼藍法顯示，百里香醌濃度增加使A431細胞死亡率上升，呈濃度依賴性;與對照組比較，低、中、高濃度實驗組A431細胞遷移能力降低;與對照組比較，經百里香醌處理后A431細胞Bax表達增加，Bcl-2表達降低;Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，不同濃度百里香醌處理后A431細胞Bax、cyto-C、caspase-3和PARP表達水平增加，而Bcl-2表達下降。結論：百里香醌具有抑制A431細胞增殖、侵襲以及誘導凋亡的作用，其機制可能是Bax/Bcl-2比值升高，促使釋放至胞漿中Cyto C增加，進而激活Caspase-3以及PARP蛋白有關。

[關鍵詞]百里香醌;人皮膚鱗狀細胞癌;增殖;凋亡;遷移

[中圖分類號]R739.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）06-0114-04

Thymoquinone Regulates Caspase-3/Bax/Bcl-2 Signaling Pathway and Induces Proliferation and Apoptosis of Cutaneous Squamous Cell Carcinoma

ZHOU Xiao-qian，JIN Xing-ji，YANG Zhu-sheng，YANG Xiu-min

（Department of Dermatology，Beijing Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of thymoquinone on the proliferation and apoptosis of human cutaneous squamous cell carcinoma A431 cells and its possible mechanism. Methods? A431 cells were divided into the control group and the low， medium and high concentration experimental groups. The control group was cultured with DMEM， while the experimental-L， M， H groups were cultured with DMEM containing 1， 15 and 30 μg/ml thymoquinone， respectively. The proliferation of A431 cells was detected by MTT. The survival of A431 cells was observed by trypan blue method. The migration of A431 cells was detected by scratch test. The expression of Bax and Bcl-2 protein was detected by immunofluorescence. The expression of Bax， Bcl-2， Caspase-3， Cyto C and PARP protein in A431 cells were detected by Western blot. Results? Thymoquinone can effectively inhibit the proliferation of human skin squamous cell carcinoma A431 cells in a concentration and time-dependent manner. Trypan blue assay showed that the mortality of A431 cells increased with the increase of thymoquinone concentration. Compared with the control group， the migration ability of A431 cells in the experimental-L， M， H groups was decreased. Compared with the control group， the expression of Bax increased and the expression of Bcl-2 decreased in A431 cells treated with thymoquinone. Compared with the control group， the expression levels of Bax， Cyto-c， Caspase-3 and PARP were increased in A431 cells treated with different concentrations of thymoquinone， while the expression of Bcl-2 was decreased. Conclusion? Thymoquinone can inhibit the proliferation， invasion and induce apoptosis of A431 cells. The mechanism may be related to the increase of the ratio of Bax/Bcl-2， the increase of Cyto C released into the cytoplasm， and the activation of Caspase-3 and PARP protein.

Key words： thymoquinone; human cutaneous squamous cell carcinoma; proliferation; apoptosis; migration

人體皮膚是最直接與外界接觸的器官，有助于吸收、分泌和免疫，是人體抵御外界有害物質侵入的第一道防線[1]。近年來，皮膚鱗狀細胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）在皮膚非黑色素細胞性惡性腫瘤中發病率居第二位，且呈增高趨勢[2]。然而，許多公眾對皮膚癌缺乏認識，導致延誤診斷，影響及時有效的治療，嚴重影響患者的健康和生活。黑種草籽油是從黑種草中提取的油類物質，百里香醌（Thymoquinone，TQ）是其中的主要活性成分，具有抗炎、抗微生物、抗氧化和免疫調節作用[3]。大量研究報道，百里香醌可以通過多種機制參與不同類型腫瘤細胞的抗癌作用，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌等[4-5]。但百里香醌關于鱗狀細胞癌的作用機制尚未闡明，本研究旨在探討百里香醌對A431細胞增殖、凋亡、遷移的影響，并探討其可能機制。

1? 材料和方法

1.1 試劑和儀器：百里香醌（美國Santa Cruz公司）;DMEM培養基（南京凱基生物科技發展有限公司）;多克隆Bcl-2相關X蛋白（BAX）、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、細胞色素C氧化酶（Cyto C）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）;噻唑藍（MTT）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）;轉膜儀（美國，BIORAD）;多功能酶標儀（美國，Biotek）。

1.2 細胞株和分組：A431細胞來源于中國科學院上海細胞庫，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培養，細胞置于5% CO2、37℃孵育箱中，相對濕度為（85±5）%，70%時融合后，可用于進一步的實驗;將A431細胞分為對照組（Control），低、中、高濃度實驗組，對照組采用DMEM培養基培養，而低、中、高濃度實驗組分別采用含1、15、30μg/ml百里香醌的DMEM培養基培養。

1.3 MTT法檢測百里香醌對A431細胞活力影響：用不同濃度（1、15、30μg/ml）的百里香醌處理A431細胞（1×106個/毫升），將處理后的細胞培養24、48和72h，用MTT法測定細胞活力，二甲基亞砜溶解細胞中的藍紫色結晶物，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長下測定其吸光值，細胞活力用陰性對照（0d）的相對百分比表示。

1.4 臺盼藍染色試驗檢測細胞存活：將A431細胞（1×106個/毫升）接種到6孔培養板中，并置于5% CO2、37℃孵育箱中培養過夜，然后用0、1、15和30μg/ml百里香醌處理細胞24h，胰蛋白酶消化，細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9：1混勻，孵育3min后，在顯微鏡下觀察（死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染）。

1.5 劃痕試驗檢測百里香醌對A431細胞遷移：將各組A431細胞接種于6孔板中，待細胞生長至融合時，用無菌20μl槍尖垂直線性劃痕，用PBS洗2遍，洗去細胞碎片和死細胞，加1 000μl培養基繼續培養，劃痕后0、24h拍照，比較各組間劃痕愈合的差異。

1.6 免疫熒光法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達[6]：將百里香醌（0，15μg/ml）處理24h的A431細胞用4%多聚甲醛固定15min，然后PBS清洗，加入0.5% riton X-100處理15min（再次清洗），并用5%羊血清封閉30min，加入一抗Bax（1：2 000稀釋）和Bcl-2（1：1 000稀釋），4℃下孵育過夜，PBS沖洗細胞，加入FITC偶聯抗兔IgG室溫下孵育1h，沖洗，加入DAPI復染，用熒光顯微鏡檢測觀察。

1.7 Westernblot檢測各組A431細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達[7]：用百里香醌處理細胞48h，離心RIPA裂解液裂解細胞并提取蛋白，BCA法蛋白定量。每孔20μl上樣，樣品直接用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離，將蛋白轉至PVDF膜，于室溫下用5%脫脂牛奶封閉2h，一抗4℃下孵育過夜，隨后TBST洗膜，室溫下與HRP結合的二抗孵育1h，用增強化學發光（ECL）化學發光試劑顯色，曝光成像，使用Image J軟件對得到的圖像進行掃描和量化。

1.8 統計學分析：采用SPSS 7.0軟件進行數據分析，所有數據用均數±標準差（x?±s）表示，通過單因素方差分析（ANOVA）進行多組比較，P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 各組A431細胞增殖情況比較：與陰性對照組（0d）相比，經百里香醌（15、30μg/ml）治療后細胞活力下降（P<0.05），且不同濃度百里香醌治療后A431細胞活力逐漸降低呈劑量及時間依賴性，而經1μg/ml百里香醌治療后，各時間點A431細胞活力無顯著性差異（P>0.05）。見圖1。

2.2 各組A431細胞活性比較：臺盼藍法觀察發現，死細胞呈明顯的藍色染色，無色透明細胞為活細胞。對照組A431細胞呈圓形、無色、透明，形狀規則，呈細胞間粘附，很少有藍色染色的死細胞;經低濃度百里香醌處理后，觀察到一些相互粘附的無色細胞，而一些細胞被染成藍色，而百里香醌濃度增加會導致藍色染色細胞縮小、數量相應增加，呈分散狀。見圖2。

2.3 百里香醌對各組A431細胞遷移影響：與對照組（0h）相比，24h后對照組劃痕逐漸愈合;24h后中、高濃度實驗組劃痕距離大于對照組（0h）。見圖3。

2.4 百里香醌對A431細胞Bax和Bcl-2蛋白表達影響：Bax和Bcl-2蛋白分布在細胞質中。與對照組相比，經15μg/ml百里香醌處理后A431細胞Bax表達增加，Bcl-2表達降低。此外，與對照組相比，還觀察經百里香醌處理后活細胞（DAPI染色的藍色細胞）數量減少，見圖4～5。

2.5 百里香醌對A431細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達影響：與對照組相比，經不同濃度百里香醌（0、1、15、30μg/ml）處理后A431細胞中Bax、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達逐漸升高，而Bcl-2表達下降，見圖6～7。

3? 討論

皮膚鱗狀細胞癌（cSCC）是一種起源于表皮或附屬器角質形成細胞的皮膚惡性腫瘤，嚴重危害人類健康[8]。盡管大部分皮膚鱗狀細胞癌都能通過手術切除，但仍有部分cSCC可以通過復發、轉移等途徑導致死亡，對于這些高危型cSCC至今仍無有效治療方案[9]。

百里香醌（TQ）作為一種天然活性成分，對多種惡性腫瘤如：肝癌、胰腺癌、大腸癌、肺癌、皮膚癌等均有治療作用[10]。研究還發現，百里香醌在多種癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等過程中能起到抑制性作用[11]。然而，TQ對cSCC細胞增殖、遷移及凋亡的影響目前仍不明確，因此本研究探討TQ是否通過Caspase-3/Bax/Bcl-2信號通路影響皮膚鱗狀細胞癌A431的凋亡，為皮膚鱗狀細胞癌的治療提供相關的實驗依據。

MTT法檢測顯示，與陰性對照（0d）相比，不同濃度百里香醌（15、30μg/ml）治療后A431細胞活力下降，且隨時間延長而逐漸降低，這說明百里香醌抑制A431細胞增殖具有劑量和時間依賴性。另一方面，臺盼藍染色顯示，經低濃度百里香醌處理后，一些細胞被染成藍色，隨著百里香醌濃度增加藍色染色細胞萎縮、數量相應增加，呈分散狀，觀察到不貼壁細胞，這說明百里香醌濃度的增加會導致癌細胞死亡。劃痕試驗結果顯示，24h后，中、高濃度實驗組劃痕距離大于對照組（0h），說明百里香醌能抑制A431細胞的遷移，且具有劑量依賴性。

細胞凋亡過程不僅受到抗凋亡和促凋亡效應分子的嚴格調控，如Bcl-2蛋白家族，還可以通過多種途徑進行調節[12]。Bcl-2家族包含抑制（Bax）和促進細胞凋亡（Bcl-2）兩類功能相反的蛋白質[13]。Bax/Bcl-2的表達比率對于誘導細胞凋亡至關重要，這個比率決定并調節細胞進入凋亡階段的進程[14]。Bax/Bcl-2比值的增加會刺激細胞色素C（Cyto C）從線粒體釋放到細胞質中，細胞質中的Cyto C與Apaf-1結合，激活Caspase-3和PARP[15]。活化的Caspase-3是執行細胞凋亡的關鍵因子，負責關鍵細胞蛋白的切割和失活[16]，而PARP是一種促進DNA損傷修復的酶[17]。Western blot檢測結果，經不同濃度百里香醌處理后，A431細胞中Bax、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達逐漸升高，而Bcl-2表達下降。這提示Bax/Bcl-2比值升高，促使釋放至胞漿中Cyto C增加，可能與輔助因子Apaf-1結合并在ATP或dATP存在下促使其形成多聚體，進而激活Caspase-3以及PARP蛋白;免疫熒光染色結果顯示，Bax和Bcl-2在細胞質中廣泛分布，百里香醌處理后Bax和Bcl-2表達分別增加和減少，這進一步證實了百里香醌誘導Bax/Bcl-2比值的增加及細胞凋亡，與Western blot檢測結果基本一致。

綜上所述，本研究結果表明，百里香醌能抑制A431細胞增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能與百里香醌通過激活線粒體途徑，上調Bax/Bcl-2，進而促進Caspase-3、Cyto C和PARP在A431細胞中的表達，導致細胞凋亡有關。

[參考文獻]

[1]鄭志忠，李利，劉瑋，等.正確的皮膚清潔與皮膚屏障保護[J].臨床皮膚科雜志，2017，46（11）：824-826.

[2]張佳音，鐘咪，饒美榮，等.皮膚鱗狀細胞癌細胞中BAG-1表達變化對細胞增殖、凋亡的影響及機制[J].山東醫藥，2018，58（45）：9-12.

[3]Hosseinzadeh H，Parvardeh S.Anticonvulsant effects of thymoquinone， the major? constituent of Nigella sativa seeds， in mice[J].Phytomedicine，2004，11（1）：56-64.

[4]蔡偉，楊佳丹，高珊，等.百里香醌對脂多糖誘導大鼠心肌纖維化的保護作用及機制研究[J].中國藥房，2019，30（4）：464-468.

[5]Woo CC，Kumar AP，Sethi G，et al.Thymoquinone： potential cure for inflammatory disorders and cancer[J].Biochem Pharmacol，2012，83（4）：443-451.

[6]涂幸，羅利，劉藝琳，等.葡萄籽原花青素提取物對HT22細胞糖氧剝奪損傷的保護作用[J].神經解剖學雜志，2020， 36（1）：57-64.

[7]魏明，師廣勇，劉佳，等.生存素小分子干擾RNA對皮膚鱗狀細胞癌A431細胞生存素基因表達及生物學功能的影響[J].中華皮膚科雜志，2018，51（4）：305-309.

[8]昝雪娟，榮冬蕓，潘軍玲，等.姜黃揮發油聯合順鉑對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖和凋亡的影響及機制[J].中華皮膚科雜志，2018，51（4）：294-298.

[9]王瑞，王菲菲，楊俊亞.手術切除聯合液氮冷凍治療皮膚鱗狀細胞癌患者的臨床療效觀察[J].中華老年醫學雜志，2019，38（12）： 1398-1400.

[10]Masood AK.Thymoquinone， a constituent of prophetic medicine-black seed， is a miracle therapeutic molecule against multiple diseases[J].Int J Health Sci （Qassim），2019，13（1）：1-2.

[11]Zhu WQ，Wang J，Guo XF，et al.Thymoquinone inhibits proliferation in gastric cancer via the STAT3 pathway in vivo and in vitro[J].World J Gastroenterol，2016，22（16）：4149-4159.

[12]王海臻，蔡丹純，廖丹丹，等.內質網應激介導滋養細胞凋亡在妊娠期肝內膽汁淤積癥中的作用及機制[J].南方醫科大學學報，2018，38（5）：572-577.

[13]程新燕，符翠莉.芹菜素對大鼠骨肉瘤細胞凋亡及相關蛋白Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9，細胞色素C的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（15）：139-142.

[14]單海軍，曹彩紅，張英英，等.補腎開竅祛痰方對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬神經元凋亡基因Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比例變化的影響[J].時珍國醫國藥，2018，29（6）：1336-1338.

[15]孫吉鳳，何海濤.黃芩素通過線粒體凋亡途徑誘導體外培養喉癌細胞凋亡的機制[J].中國老年學雜志，2018，38（8）：1947-1951.

[16]竇雪嬌，陳松，張紅.七氟烷經不同途徑吹入對體外循環犬肺組織呼吸功能和Caspase-3表達的影響[J].重慶醫學，2019，48（6）：917-920.

[17]李玲玲，趙玉霞.PARP-1及其抑制劑與腫瘤發生、發展及放射敏感性關系研究進展[J].中華放射腫瘤學雜志，2017，26（11）：1350-1353.

[收稿日期]2021-01-06

本文引用格式：周曉謙，金星姬，楊竹生，等.百里香醌調控Caspase-3/Bax/Bcl-2信號通路誘導人皮膚鱗狀細胞癌增殖和凋亡的作用機制研究[J].中國美容醫學，2021，30（6）：114-117，163.