關于親權鑒定基因座一步突變分析

許玲利 張靜 杜祎銘

摘 要：目的：分析親權二聯體親子鑒定中 STR 出現一步突變基因座的原因。方法：應用多重 PCR 擴增技術及毛細管電泳技術進行基因座分型，進行DNA 檢測分析。結果：常染色體 STR 檢測結果中 D6S1043 基因座存在對樣一步突變，其他 STR 基因座均符合遺傳規律。結論：親權鑒定時發現基因座出現一步突變，必須增加 STR 位點檢測，計算累計親權指數， 正確判斷親權關系。

關鍵詞：親權鑒定;短串聯重復序列;突變

短串聯重復序列（Short Tandem Repeat，STR） 是人類的重要的遺傳標記之一。在法醫學親子鑒定及遺傳病學分析中具有有重要作用[1]。STR 基因座突變的現象是親子鑒定中普遍存在的，突變的要機制與復制滑動突變密切相關。

所謂一步突變是指只涉及一個基序的加或減稱為一步突變，約占 STR 基因座的 90%，約有10%的個體涉及多個序列突變，稱多步突變 [3]。最多突變步數為四步。STR 核心序列的變異可能導致親子鑒定的誤判 [4]。因此法醫物證人員，尤其關注 STR 基因座突變。現對 1 例出現一步基因座突變的親子鑒定案件進行分析，報告如下。

1 儀器、試劑及方法

1.1儀器及試劑

1.1.1 GeneAmp 9700 熱循環儀、3500xl 型遺傳分析儀（美國應用生物系統公司）。

1.1.2試劑：21Plex 系統熒光標記檢測試劑盒（ 2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA 聚合酶、 PCR Grade Water、Orange-500 。江蘇蘇博醫學科技南京有限公司）。AGCU EX 21+1 熒光檢測試劑盒 （ ReactionMix、Primers、Taq 酶、Allelic Ladder、 AGCU MarkerSIZ-500;無錫中德美聯生物技 術有限公司）;X-STR 系統熒光標記檢測試 劑盒（包括 5×PCR 反應緩沖液Ⅳ、5×17X 引物混合 物、去離子水、ORG-500;基點認知技術（北京） 有限公司）。

1.1.3標本：選擇直徑 1 cm 大小血斑一份，常溫晾干后存儲于 -20 ℃冰箱。

1.2方法： PCR 擴增和電泳分型：PCR 擴增體系和擴增程序依據各試劑盒說明書嚴格操作，PCR 擴增采用血斑直接擴增。擴增陽性和陰性對照方法如下：每次擴增以陽性對照 DNA作陽性對照，陰性對照擴增管中加入純水。擴增產物應用 ABI3500xl 型遺傳分析儀進行毛細管電泳，由Data Collection v3.0 數據收集軟件收集電泳數據信息，電泳完成后把生成的數據導入 GeneMapper ID-X v1.5 軟件中分析查看各基因座的基因型。

1.3 統計學分析： 根據中國漢族人群 STR 基因座的等位基因頻率，根據規范推薦突變率，μ 為平均突變率 0.002，進行親權指數、累積親權指數的計算。所有操作均按照法醫物證鑒定 X-STR 檢驗規范》、《 親權鑒定技術規范書》執行。

2 結果

2.1 常染色體 STR 基因座分型結果

親子鑒定案件運用 21Plex 系統檢測 21 個基因座 分型結果是否符合遺傳規律。在該例親子鑒定的案 件中，發現存在一步突變的可能，涉及的 STR 基因座 為 D6S1043，其余 20 個基因座的檢測結果全部符合遺 傳規律（圖 1）。

父親 D6S1043 基因型為11，20”，孩子 D6S1043 基因型為“19，21”，孩子位點“21”與父親 位點“20”相差一個重復單位考慮有一步突變的可能。D3S1358等20個STR基因座均為人類的遺傳學標記，遵循孟德爾遺傳定律，聯合應用可進行親權鑒定，其累積非父排除概率大于0.9999。綜上檢驗結果分析，除D6S1043基因座外，父親均能提供給孩子必需的等位基因。在D6S1043基因座，孩子的基因型為“19，21”父親的基因型為“11，20”，父親不能提供給孩子必需的等位基因“19，21”，不符合遺傳規律。按照GB/T 37223-2018《親權鑒定技術規范》中不符合遺傳規律情形時親權指數的計算方法，D6S1043基因座的親權指數為0.0396。綜上20個STR基因座的累積親權指數為19872.9500。

2.2 新增基因座分型結果

采用 AGCU EX21+1 試劑盒進一步檢測，包含 21 個 STR 基因座，其中 D19S433 基因座 21Plex 檢測系 統中也包含， 采用 AGCU EX21+1 試劑盒進一步檢測，包含 21 個 STR 基因座，其中 D19S433 基因座 21Plex 檢測系 統中也包含， D6S474等21個STR基因座均為人類的遺傳學標記，遵循孟德爾遺傳定律，聯合應用可進行親權鑒定，其累積非父排除概率大于0.9999。父親F在D6S474，D12ATA63和D1S1677等基因座不能提供給孩子必需的等位基因（圖 2）。經計算，累積親權指數為9.9965×10-20（注：小于0.0001）。

2.3 應用 GoldeneyeTM DNA 身份鑒定系統 17X 試劑盒，這 16 個 X-STR 基因座在女性群體的累積個人識別率為 0.999 999 999 999 992，在男性群體的累積個人識別率為 0.999 999 996 577 712，在三聯體中的累積非父排除率為 0.999 999 971，在二聯體中的累積非父排除率為 0.999 992 574。 這 16 個X-STR 基因座達到了法醫物證學應用要求，尤其對特殊的親權鑒定案件具有重要的應用價值。X-STR 基因座上的分型結果： 本案例又增加檢測了17 個 X-STR 基因座，被 檢標本 C 與被檢標本 F 的X-STR 基因座大部分不一致，結果如表 1 所示。

2.4依據人類染色體遺傳規律，孩子的遺傳基因一 定來自親生父母雙方 [2]。綜上檢驗結果分析，D3S1358等40個STR基因座均為人類的遺傳學標記，遵循孟德爾遺傳定律，聯合應用可進行親權鑒定，其累積非父排除概率大于0.9999。綜上檢驗結果分析，父親F在D6S1043，D6S474和D12ATA63等基因座不能提供給孩子必需的等位基因。經計算，累積親權指數為5.2314×10-19（注：小于0.0001）。40個常染色體STR基因座分型后 CPI 值為5.2314×10-19（注：小于0.0001）。案例突變 基因座位點和 PI 計算結果見表 2。

3討論：所謂的突變均是建立于在認定親權關系的假設 上。STR 基因座突變與遺傳多態性程度有著一定的 關系，其主要機制為復制滑動。復制滑動突變主要表 現為 STR 基因座等位基因重復單位的增加或減少 [3]。 序列結構比較均一的基因座容易發生突變，而等位基 因中含有不完全序列的基因座發生突變的概率較低，擴增片段較大的 STR 基因座更容易發生突變，這可 能是由于重復單位多的基因座其長度也較長，必然多 態性程度也較高，其突變概率會隨之增加 [4]。

司法鑒定技術規范要求累計親權指數大于 10 000 時，支持被檢測男子（或被檢測女子）是孩子 生物學父親（或母親），累計親權指數小于 0.000 1 支持被檢測男子（或被檢測女子）不是孩子生物學父親 （或母親）。如果只有 1～2 個基因座不符合遺傳規律，累計親權指數在 0.000 1～10 000 之間應增加檢測 其他高度多態性且遺傳穩定的 STR 基因座，以避免 由于 STR 基因座突變導致錯誤地排除親權關系。 該二聯體案例首先用 21Plex 體系檢測 20 個常染色體STR，出現一個矛盾基因座 D6S1043 ，父親F為（19，21）， 孩子 C 為（11，20），相差 一個重復單位，累計親權指數 19872.9500。考慮到是父女鑒定，使 用 X-STR 試劑盒進一步擴增檢測，被檢樣本 F 與樣 本C的 X-STR 基因型不相同，說明二人不符合同一母系 遺傳規律。因為 X-STR 基因座具有伴性遺傳的特征，女性在X-STR基因座具有兩個等位基因，一個來自于父親，一個來自于母親;男性在X-STR基因座僅具有一個等位基因，且來自于母親 ， 不同基因座中存在連鎖的可能。本案例雖然檢測了 17個 X -STR 基因座，但是部分基因座之間存在連鎖 不平衡，鑒于不同的群體中連鎖狀態不相同，群體遺 傳學數據有限，檢測結果只是作為參考，未計算親權 指數。 STR 基因座等位基因的突變與性別也有著一定 的相關性。研究發現，來源于父親的突變多于來源于 母親的突變?；虻耐蛔兟逝c細胞分裂次數密切相關。由于男性精原細胞在發育成為精子前要經過 多次分離，且分裂次數遠遠多于女性卵原細胞分裂的 次數，因而 DNA 復制發生滑動錯配的機會就增多，突 變概率相應增加。除此之外，年齡等因素的影響也會 導致男性 DNA 突變率高于女性 [4]。

總之，常染色體20個STR基因座 檢測結果中 D6S1043 基因座存在一步突變，其他 STR 基因座均符合遺傳規律，雖然累計親權指數大于 10 000 時，支持被檢測男子（或被檢測女子）是孩子 生物學父親（或母親），如果只有 1～2 個基因座不符合遺傳規 律，累計親權指數大于 10 000 時，應增加其他高度多態性且遺傳穩定的 STR 基因座的檢測，以避免 由于 STR 基因座突變導致錯誤地排除親權關系。必須增加 STR 位點檢測，計算累計親權指數， 正確判斷親權關系。

參考文獻

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[4] 楊玉有，張丹妍，楊智曦，等.親子鑒定中D18S51基因座突變分 析與應對[J]中西醫結合心血管病雜志（電子版 ），2018，6（16）：187-188.

河南省生殖健康科學技術研究院 河事緣法醫物證司法鑒定所 河南鄭州 450003