管花苷B對(duì)肝癌細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制

歐鵬程 姚杰 吳敏娜 楊智 謝帆慈

摘? 要：目的? 探討分析管花苷B對(duì)肝癌細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移的影響及作用機(jī)制。方法? 取人肝癌細(xì)胞株HepG2，隨機(jī)分為對(duì)照組和管花苷B不同濃度組，對(duì)照組中僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液，管花苷B不同濃度組中分別加入1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的管花苷B和細(xì)胞培養(yǎng)液。采用MTT法測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率;采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的體外侵襲、轉(zhuǎn)移能力;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，Westem blot法檢測(cè)RCD44的表達(dá)。結(jié)果? 細(xì)胞增殖抑制率隨管花苷B濃度的升高而增大;細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力均隨管花苷B濃度的升高而降低;與對(duì)照組相比，各濃度的管花苷B均可顯著增加GO/G1期肝癌細(xì)胞的比例，減少S期與G2/M期肝癌細(xì)胞的比例;肝癌細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)量隨管花苷B濃度和作用時(shí)間的增加而減少。結(jié)論? 管花苷可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移，且具有明顯的濃度依賴(lài)性，其機(jī)制可能與管花苷B可影響細(xì)胞周期進(jìn)程和下調(diào)CD44蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：管花苷B;肝癌細(xì)胞;增殖;侵襲;轉(zhuǎn)移;作用機(jī)制

中圖分類(lèi)號(hào)：R725.6? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1009-8011（2021）-17-0157-03

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，躍居全球癌癥發(fā)病率第5位，病死率為惡性腫瘤致死病因的第2位[1]。外科手術(shù)是治療肝癌最有效的方法，但肝癌起病隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已為中晚期，出現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處侵襲和轉(zhuǎn)移，已失去根治性切除的機(jī)會(huì)，部分患者即使可局部切除病灶，但術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療效果不理想、預(yù)后差的主要原因，因此尋找有效抑制肝癌轉(zhuǎn)移的藥物對(duì)提高患者預(yù)后具有重要的臨床意義。管花苷B是從肉蓯蓉屬植物管花肉蓯蓉中分離得到的一種苯乙醇苷類(lèi)化合物，近年來(lái)大多學(xué)者對(duì)管花苷B的藥理學(xué)研究主要集中在抗氧化、抗衰老、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、保肝等方面[2]。然而其抗腫瘤作用的研究鮮少報(bào)道，本研究以人肝癌細(xì)胞株HepG2為研究對(duì)象，通過(guò)觀察管花苷B對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移的影響，探討管花苷B抗肝癌作用的可能機(jī)制，為抗肝癌的藥物研究提供理論依據(jù)。

1? 資料與方法

1.1? 材料與儀器

人肝癌細(xì)胞株HepG2（中科院上海細(xì)胞生物研究所），管花苷B（生產(chǎn)企業(yè)：成都格普特生物科技有限公司，CAS號(hào)112516-

04-8），DMEM培養(yǎng)液（生產(chǎn)企業(yè)：武漢純度生物科技有限公司）、胎牛血清（生產(chǎn)企業(yè)：上海麥克林生化科技有限公司），胰酶、青霉素-鏈霉素（生產(chǎn)企業(yè)：北京索萊寶科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO，生產(chǎn)企業(yè)：上海吉至生化科技有限公司），Transwell（生產(chǎn)企業(yè)：上海惠研生物科技有限公司），Matrigel基質(zhì)膠（生產(chǎn)企業(yè)：BD公司），細(xì)胞周期試劑盒（生產(chǎn)企業(yè)：碧云天生物技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞儀（生產(chǎn)企業(yè)：廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技有限公司），CD44、抗肌動(dòng)蛋白（β-actin）（生產(chǎn)企業(yè)：南京善本生物科技有限公司），BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（生產(chǎn)企業(yè)：武漢科斯坦生物科技有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素各100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁達(dá)90%融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2? 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算

采用MTT法測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率。將HepG2細(xì)胞按2×105/mL接種于96孔板，每組5孔。待細(xì)胞貼壁后吸凈上清液，并分為兩組，對(duì)照組僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液，管花苷B組中分別加入1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的管花苷B和細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，分別加入5 g/L的MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后加入200 μL的DMSO，震蕩15 min，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)波長(zhǎng)為490 mm時(shí)各組吸光密度（OD）值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。計(jì)算公式如下：細(xì)胞增殖抑制率=（1-給藥組OD/對(duì)照組OD）×100%。

1.2.3? 細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)

采用Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞侵襲能力。在預(yù)冷的Transwell小室中加入稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠50 μL，37 ℃培養(yǎng)2 h待其凝固。取各組HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞密度為4×104/mL的懸液待用。在Transwell小室上室中加入用DMEM培養(yǎng)液（含0.1%胎牛血清）稀釋的HepG2細(xì)胞懸液200 μL，下室中加入500 μLDMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后使用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下拍照，并觀察穿模細(xì)胞數(shù)，記錄5個(gè)高倍鏡下視野細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.4? 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力

操作步驟同細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)中未加入Matrigel基質(zhì)膠。

1.2.5? 細(xì)胞周期檢測(cè)

收集經(jīng)不同條件處理后的細(xì)胞懸液，置于1000 r/min的離心機(jī)內(nèi)離心5 min，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，再次離心去除PBS后使用70%乙醇固定，4 ℃保存過(guò)夜后離心去上清液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)，并分析不同周期細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.6? 細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Westem blot法檢測(cè)細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)。取各組處理24 h、48 h后的細(xì)胞，分別加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，嚴(yán)格按照BCA試劑盒說(shuō)明測(cè)定蛋白濃度。取50 μL總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后孵育一抗（CD44抗體，β-actin抗體）;4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加入二抗（辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG），室溫孵育1.5 h，TBST洗滌后加入ECL發(fā)光液曝光，利用Image J軟件分析CD44蛋白表達(dá)灰度值。

1.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間比較行t檢驗(yàn)、單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 各組細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比

細(xì)胞增殖抑制率隨管花苷B濃度的升高而增大。見(jiàn)表1。

2.2? 各組細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力對(duì)比

細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力均隨管花苷B濃度的升高而降低。見(jiàn)表2。

2.3? 管花苷B對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組相比，各濃度的管花苷B均可顯著增加GO/G1期肝癌細(xì)胞的比例，減少S期與G2/M期肝癌細(xì)胞的比例。見(jiàn)表3。

2.4? 管花苷B對(duì)肝癌細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)的影響

肝癌細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)量隨管花苷B濃度和作用時(shí)間的增加而減少。見(jiàn)表4。

3? 討論

肝癌是臨床常見(jiàn)的具有較高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤之一，肝癌治療效果不理想的主要原因是早期臨床癥狀不明顯，且易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。調(diào)查[3]顯示，超過(guò)90%的癌癥患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移提示癌細(xì)胞惡性程度提高，治療難度增大，尋找抗肝癌轉(zhuǎn)移作用的藥物對(duì)腫瘤研究領(lǐng)域及癌癥患者具有重大意義。肝癌的轉(zhuǎn)移涉及多基因、多階段相互作用，逐漸造成細(xì)胞表型的改變以提高腫瘤惡性程度，最終實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，并在轉(zhuǎn)移部位增殖。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的復(fù)雜過(guò)程包括腫瘤細(xì)胞脫落和黏附、細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤血管形成等[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，在肝癌轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，作為介導(dǎo)細(xì)胞黏附作用的CD44細(xì)胞黏附分子出現(xiàn)明顯的異常表達(dá)。CD44細(xì)胞黏附分子具有高度異質(zhì)性，主要分為兩個(gè)亞型，CD44s標(biāo)準(zhǔn)型和CD44v變異型，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、傷口愈合、血管生成、癌癥的發(fā)展等多種生理、病理過(guò)程[6]。增生的上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞中均可檢測(cè)到CD44s標(biāo)準(zhǔn)型，而CD44v變異型與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。相關(guān)研究[7]表明，肝癌、肺癌、大腸癌、喉癌、宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移與CD44高表達(dá)密切相關(guān)，且CD44表達(dá)程度與患者臨床分期、分化程度存在一定的相關(guān)性。研究[8]報(bào)道，CD44v變異型高度表達(dá)的肝癌患者中多伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。

本研究通過(guò)MTT法、Transwell細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)測(cè)定了管花苷B對(duì)肝癌細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖抑制率隨管花苷B濃度的升高而增大，表明管花苷B對(duì)肝癌細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且具有明顯的濃度依賴(lài)性;細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力均隨管花苷B濃度的升高而降低，表明1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的管花苷B均對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用，且管花苷B濃度越高抑制作用越明顯。與對(duì)照組相比，各濃度的管花苷B均可顯著增加GO/G1期肝癌細(xì)胞比例，減少S期與G2/M期肝癌細(xì)胞比例，提示管花苷B可能對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程具有一定的影響作用。為進(jìn)一步探討管花苷B抗肝癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制，我們蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證了管花苷B對(duì)肝癌細(xì)胞中CD44表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)量隨管花苷B濃度和作用時(shí)間的增加而減少，推測(cè)管花苷B抑制肝癌細(xì)胞的增殖侵襲轉(zhuǎn)移作用可能通過(guò)降低CD44表達(dá)而起作用。

綜上所述，管花苷可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移，且具有明顯的濃度依賴(lài)性，其機(jī)制可能與管花苷B可影響細(xì)胞周期進(jìn)程和下調(diào)CD44蛋白表達(dá)有關(guān)。

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