補(bǔ)腎降脂方調(diào)控自噬與膽固醇流出干預(yù)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的機(jī)制研究

閆 黎 申定珠

上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海 200031

作為心腦血管事件關(guān)鍵病理基礎(chǔ)的動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS），膽固醇外排是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）的關(guān)鍵步驟，在AS 病理進(jìn)程中扮演重要角色[1]。肝X 受體α（liver X receptor alpha，LXRα）在RCT 過程中發(fā)揮重要作用[2]。RCT 靶點(diǎn)蛋白ATP 結(jié)合膜盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP-binding membrane cassette transport protein A1，ABCA1）可調(diào)節(jié)膽固醇外流[3]。激活LXRα/ABCA1 途徑可促進(jìn)RCT、增加膽固醇外排，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂[4]。自噬是高度保守的自我降解過程，可選擇性將脂滴吞噬并遞送至溶酶體降解[5]。基于補(bǔ)腎法乃AS 行之有效的臨床治則[6]，結(jié)合補(bǔ)腎降脂方有效調(diào)控高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝紊亂、調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的前期工作基礎(chǔ)[7-8]，本研究從自噬介導(dǎo)膽固醇流出角度解析補(bǔ)腎降脂方干預(yù)治療AS 的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6 周齡雄性ApoE-/-小鼠與C57BL/6J小鼠，SPF 級，體重（20±3）g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（蘇）2018-0008，喂飼于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級動物房。方案通過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理審查（PZSHUTCM200628005）。

1.1.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎降脂方顆粒由菟絲子、枸杞子、沙苑子、女貞子、覆盆子、黑大豆各10 g 組成（江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，19120222、19100372、19080302、19100472、19110522、19090562）；阿托伐他汀片（輝瑞制藥有限公司，DT1537）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）（Sigma-Aldrich 公司，M9281）；油紅O 染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1016）；FILIPIN 染色試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，GMS80059.3）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，E1005、E1006）；兔抗LXRα、鼠抗ABCA1（Abcam 公司，ab176323、ab18180）；兔抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）A/B、兔抗p62、兔抗GAPDH（Cell Signaling Technology 公司，4108S、23214S、5174S）。

1.2 分組

100 只6 周齡雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)至8 周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為模型組、補(bǔ)腎組、他汀組、3-MA 組，每組25 只，高脂飼料（小鼠常規(guī)基礎(chǔ)飼料+21%脂肪+0.15%膽固醇）喂飼；25 只同品系、同周齡雄性C57BL/6J 小鼠為正常對照。補(bǔ)腎組、他汀組分別以補(bǔ)腎降脂方水溶液（3842.85 mg/kg）、阿托伐他汀水溶液（2.055 mg/kg）灌胃，0.2 ml/只，每日1 次；3-MA組以3-MA 水溶液腹腔注射（15 mg/kg），隔日1 次[9]；正常組、模型組以等體積蒸餾水灌胃，每日1 次。干預(yù)12 周。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.3.1 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色取主動脈連同心臟，10%福爾馬林固定，用于HE 染色。脫蠟→蘇木精染色→伊紅染色→封片，光學(xué)顯微鏡采集圖像，Image-Pro Plus 分析主動脈竇斑塊面積/管腔總面積。

1.3.2 油紅O 染色 取主動脈連同心臟，10%福爾馬林固定，用于油紅O 染色。切片干燥→異丙醇分化→蘇木精復(fù)染→鹽酸酒精分化→返藍(lán)液返藍(lán)→封片。數(shù)字切片掃描儀采集圖像，Image-Pro Plus 分析主動脈竇紅染脂質(zhì)面積/管腔總面積。

1.3.3 FILIPIN 染色 取主動脈連同心臟，10%福爾馬林固定。按FILIPIN 染色試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡采集圖像，Image J 分析陽性區(qū)域平均熒光強(qiáng)度。

1.3.4 透射電鏡 取主動脈弓處組織，2.5%戊二醛預(yù)固定，1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，包埋切片，透射電鏡觀察自噬小體與脂滴。

1.3.5 比色法 眼球摘除取血，離心（12 000 r/min，15 min，4℃；離心半徑為10 cm），取上清，按TC、FC 測定試劑盒說明書操作，550 nm 處測光密度（optical density，OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；膽固醇酯（cholesterol ester，CE）=TC-FC。

1.3.6 Western blot 取胸主動脈至腹主動脈段，蛋白提取及定量。SDS-PAGE 電泳濕轉(zhuǎn)，室溫封閉1.5 h，4℃過夜孵育一抗（LXRα、ABCA1、LC3A/B、p62，1∶1000；GAPDH，1∶2000）。TBST 洗膜，室溫孵育二抗（1∶3000）1 h，洗膜后顯影。結(jié)果以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 或Games-Howell 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組主動脈竇病理形態(tài)比較

正常組主動脈竇未見明顯AS 斑塊（圖1A）。模型組AS 斑塊面積比大于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)腎組、他汀組AS 斑塊面積比小于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；3-MA組AS 斑塊面積比大于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)腎組與他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（圖1B）。

圖1 各組主動脈竇HE 染色情況與斑塊面積比比較

2.2 各組主動脈竇脂質(zhì)蓄積比較

正常組主動脈竇未見明顯紅染脂質(zhì)（圖2）；模型組紅染面積大于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)腎組、他汀組紅染面積小于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；3-MA 組紅染面積大于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；補(bǔ)腎組與他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（圖3）。

圖2 各組主動脈竇油紅O 染色情況（40×）

圖3 各組主動脈竇紅染脂質(zhì)面積比比較

2.3 各組主動脈竇FC 染色情況比較

正常組主動脈竇未見明顯藍(lán)色熒光（圖4）；模型組主動脈竇陽性染色面積大于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)腎組、他汀組陽性染色面積小于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；3-MA 組陽性染色面積大于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；補(bǔ)腎組與他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（圖5）。

圖4 各組主動脈竇FILIPIN 染色情況（200×）

圖5 各組主動脈竇陽性染色面積比比較

2.4 各組主動脈自噬小體與脂滴情況

正常組主動脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，可見自噬小體；模型組主動脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，可見脂滴，未見自噬小體；補(bǔ)腎組、他汀組主動脈內(nèi)皮細(xì)胞可見自噬小體；3-MA 組主動脈內(nèi)皮細(xì)胞膜破損，細(xì)胞核形態(tài)不完整，多處可見脂滴，未見自噬小體（圖6）。

圖6 各組透射電鏡情況（20 000×）（黃：脂滴；紅：自噬小體）

2.5 各組血清TC、FC、CE 含量比較

模型組TC、FC 及CE 含量高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)腎組TC、FC 及CE 低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；他汀組TC、FC 及CE 低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；3-MA 組TC、CE 高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；補(bǔ)腎組與他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組血清TC、FC、CE 含量比較（mmol/L，）

表1 各組血清TC、FC、CE 含量比較（mmol/L，）

注：與正常組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。TC：總膽固醇；FC：游離膽固醇；CE：膽固醇酯；3-MA：3-甲基腺嘌呤

2.6 各組主動脈LXRα、ABCA1、LC3、p62 蛋白表達(dá)比較

模型組LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)低于正常組，p62 表達(dá)高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)腎組LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)高于模型組，p62 表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01）；他汀組LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)高于模型組，p62 表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；3-MA 組LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)低于模型組，p62 表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；補(bǔ)腎組與他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖7。

圖7 各組主動脈LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表達(dá)比較

3 討論

脂質(zhì)代謝紊亂是AS 形成的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，膽固醇流出為RCT 初始步驟，在AS 病理進(jìn)程中意義重大[10]。RCT 關(guān)鍵靶蛋白ABCA1 可介導(dǎo)膽固醇向apoA-Ⅰ轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)脂質(zhì)外排[11]。激活膽固醇含量的感受器LXRα 上調(diào)ABCA1 表達(dá)，促進(jìn)膽固醇流出[9]。ApoE-/-小鼠所致AS 病變與人類AS 病變相似，高脂飲食可加速AS 形成[12]。自噬活性不足或過度均可致AS[13]。自噬小體為自噬的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，電鏡是檢測自噬的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。3-MA 是廣泛應(yīng)用的自噬抑制劑[15]。自噬發(fā)生過程中，LC3-Ⅰ可脂化為LC3-Ⅱ，以LC3-Ⅱ/Ⅰ評估自噬水平：自噬降解底物p62 可反映自噬活性[16]。脂滴可經(jīng)自噬溶酶體途徑降解，即脂滴被自噬小體包裹后與溶酶體融合，甘油三酯與CE 在溶酶體中被酸性脂肪酶水解為FC 與游離脂肪酸，其中FC 外排由ABCA1 介導(dǎo)[17]。激活LXRα/ABCA1 可減少ox-LDL 誘導(dǎo)的VSMCs 脂質(zhì)蓄積，與誘導(dǎo)自噬有關(guān)[18]。在Ac-LDL誘導(dǎo)的THP-1 巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中，F(xiàn)GF21 可通過RACK1 誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)膽固醇流出[19]。本研究顯示，與正常組比較，模型組AS 斑塊、脂質(zhì)蓄積、FC 陽性染色面積及脂滴增加，TC、FC、CE 含量及p62 表達(dá)升高，自噬小體減少，LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)降低：較之模型組，3-MA 組斑塊、脂質(zhì)蓄積、FC 陽性染色面積及脂滴增加，TC、CE 含量及p62 表達(dá)升高，未見自噬小體，LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)降低。

根據(jù)臨床表現(xiàn)，AS 可歸屬“脈痹”“胸痹”等范疇。本虛標(biāo)實(shí)乃AS 病機(jī)之根，腎虛致AS 理論受諸多學(xué)者重視。本課題組前期研究證實(shí)，AS 與增齡相關(guān)，以腎虛為本；補(bǔ)腎降脂方可調(diào)控RCT、促進(jìn)自噬，進(jìn)而有效干預(yù)治療AS[7-8]；但從自噬與脂質(zhì)代謝角度探討補(bǔ)腎方藥干預(yù)AS 的機(jī)制尚待闡明[20]。補(bǔ)腎降脂方由菟絲子、枸杞子、沙苑子、女貞子、覆盆子、黑大豆組成，具補(bǔ)腎益精、降脂利脈之功。菟絲子補(bǔ)腎固精、枸杞子滋腎益精，共為君藥：沙苑子補(bǔ)腎助陽、女貞子補(bǔ)腎滋陰、覆盆子益腎固精，共為臣藥：黑大豆活血利水解毒為佐使藥。本研究顯示，補(bǔ)腎降脂方可減少AS 斑塊、脂質(zhì)蓄積、FC 及脂滴，降低TC、FC、CE 含量及p62 表達(dá)，增加自噬小體，升高LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)。

綜上，補(bǔ)腎降脂方有效干預(yù)治療AS 的作用機(jī)制可能與其調(diào)控自噬、促進(jìn)膽固醇流出有關(guān)。基于自噬與脂質(zhì)代謝的相關(guān)性，本課題組將結(jié)合體內(nèi)、體外研究，深入解析補(bǔ)腎降脂方有效干預(yù)治療AS 的科學(xué)內(nèi)涵。