HBVX區(qū)A1762T/G1764A突變對肝癌HepG2細胞自噬的影響

于飛?楊育華?趙陽?通訊作者：黃天壬

摘要：目的：探究HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對人肝癌HepG2細胞自噬的影響。方法：體外培養(yǎng)人肝癌 HepG2細胞;將HepG2細胞隨機分為慢病毒空白載體（陰性對照）組、HBX-wt（野生型）組，HBX-A1762T/G1764A（實驗）組。實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）法檢測各組細胞 LC3B、P62、Beclin-1的表達情況;蛋白印跡分析法檢測各組細胞LC3B、Beclin-1、P62蛋白的表達情況。結(jié)果：與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1基因表達水平升高（P <0.05），P62水平降低（P<0.05）;與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達水平升高（P <0.05），P62蛋白表達水平降低（P<0.05）。結(jié)論：HBV X區(qū) A1762T/G1764A雙突變可能調(diào)控了肝癌HepG2激活了細胞自噬的發(fā)生。HBV X區(qū) A1762T/G1764A突變可能是HBV所致HCC診斷和治療的潛在靶點。

關(guān)鍵詞：肝癌，HBV，HBX 區(qū)A1762T/G1764A突變，自噬

【中圖分類號】R575 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）10--02

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC簡稱肝癌）是世界最常見的惡性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，已有20多億人感染了乙肝病毒，全球HCC病例中大約53%與HBV感染有關(guān)[1]。一些報道也表明，乙肝病毒的遺傳特征，包括乙肝病毒的基因型和特定的基因突變，與肝細胞癌的發(fā)生有關(guān)[2-5]。HBx由HBV的X開放閱讀框編碼，在肝癌的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明， HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變是肝細胞癌發(fā)生的獨立危險因素[6]。HBV X 區(qū)的A1762T/G1764A突變?yōu)橛胁町惖臒狳c突變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[7]。

自噬是一種保守的過程，通過這種過程，細胞質(zhì)物質(zhì)包括錯誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細胞器和各種入侵的病原體被移除，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[8]。有研究表明，HBx可以直接與第III類磷脂酰肌醇3-激酶I（PtdIns3K）結(jié)合，增強PtdIns3K的酶活性，并在Huh7.5細胞中誘導(dǎo)病毒DNA復(fù)制的自噬[9]。本研究在體外建立了人肝癌細胞HBX突變模型，以探討HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對人肝癌HepG2細胞株自噬的影響，為肝癌治療提供可能的新靶點。

1 ? 材料與方法

1.1主要材料與試劑

人肝癌HepG2細胞株，課題組前期購買。特級澳洲胎牛血清、DMEM高糖型細胞培養(yǎng)基：美國Gbico公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qRT-PCR試劑盒：日本TaKaRa 公司。慢病毒表達載體HBX-A1762T/G1764A突變組、HBx野生型組、陰性對照組。HBX、PI3K、AKT、mTOR基因引物：上海生工生物工序股份有限公司。乙型肝炎病毒X多克隆抗體：美國Abcam公司。beta-Actin Rabbit mAb、LC3B Rabbit mAb、P62 Rabbit mAb、Beclin-1 Rabbit mAb：美國CST公司。

1.2 ?細胞分組和轉(zhuǎn)染

HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖型細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中。待細胞密度約為30%-50%時，按慢病毒使用說明書進行轉(zhuǎn)染。實驗分組：（1）轉(zhuǎn)染慢病毒空白載體的陰性對照組（NC），轉(zhuǎn)染含HBX野生基因型序列的野生型組（WT），轉(zhuǎn)染含HBX野生基因序列發(fā)生A1762T/G1764A位點聯(lián)合突變的實驗組（EG）。

1.3 ?RT-qPCR實驗檢測HBX、LC3B、P62、Beclin-1的表達

按照Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，然后按照qRT-PCR試劑盒說明進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：95 °C變性10min，60°C退火 30s、72 °C延伸 40min，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算HBX、LC3B、P62、Beclin-1表達水平。引物序列見表1。

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1.4 ?Western blot檢測HBx、LC3B、P62、Beclin-1蛋白表達

收集各組細胞，加入RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白。取30μg蛋白樣品行SDS?PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、快速封閉液封閉后，加入一抗HBx、LC3B、P62、Beclin-1、β-actin （1∶1 000），4℃搖床孵化過夜;次日洗膜后加入1∶2000稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵化1 h，TBST洗滌后，加入ECL顯色發(fā)光，凝膠成像儀成像。以為β-actin內(nèi)參，Image J軟件測定蛋白灰度值，計算各組各蛋白相對表達量。

1.5 ?統(tǒng)計學(xué)方法

以統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism 8.0分析實驗數(shù)據(jù)并進行繪圖，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 描述，多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩組間比較行LSD-t檢驗，當(dāng)P<0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?HepG2細胞慢病毒轉(zhuǎn)染驗證

將提取的總蛋白進行Western blot分析，結(jié)果如圖1所示：陰性對照轉(zhuǎn)染組未見任何條帶，而HBX-wt、HBX-A1762T/G1764A組在相對分子質(zhì)量約為17KD處存在顯著條帶，見圖1。以上結(jié)果說明成功構(gòu)建了HepG2細胞模型。

2.2 ?HBX突變對HepG2細胞LC3B、P62、Beclin-1基因表達的影響

與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組細胞LC3B、Beclin-1基因表達水平升高（P <0.05），P62基因表達水平降低（P<0.05），見表2。

2.3 ?HBX A1762T/G1764A突變對HepG2細胞LC3B、P62、Beclin-1蛋白表達情況的影響

與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達水平升高（P <0.05），P62蛋白表達水平降低（P<0.05）。見圖1。

3 ?討論

乙肝病毒感染仍然是一個主要的公共衛(wèi)生問題，在世界范圍內(nèi)造成顯著的發(fā)病率和死亡率。約20億人，即世界人口的三分之一，有過去或現(xiàn)在感染過乙肝病毒的血清學(xué)證據(jù)，目前約有3.5億人持續(xù)感染[2]。慢性乙肝可導(dǎo)致慢性活動性肝炎、肝硬變和肝癌[3]。因此，探究HBV在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，并在此基礎(chǔ)上尋找有效的措施防治HCC尤為重要。

自噬是一種分解代謝過程，通過引導(dǎo)陳舊/受損的細胞器（如線粒體）、蛋白質(zhì)聚集體和病原體進行溶酶體降解來維持細胞的動態(tài)平衡。溶酶體分解的產(chǎn)物（例如氨基酸和脂肪酸）被回收，并通過溶酶體膜運輸?shù)郊毎|(zhì)中。這些代謝物可以在蛋白質(zhì)和三磷酸腺苷的生產(chǎn)中重復(fù)使用[10]。在新陳代謝壓力或營養(yǎng)供應(yīng)不足的時期，自噬迅速上調(diào)，以維持能量生產(chǎn)，并為基本的細胞功能提供基石。同樣，缺乏葡萄糖或氨基酸或暴露在低氧環(huán)境中的細胞依賴自噬生存[11-12]。自噬缺陷導(dǎo)致蛋白質(zhì)在肝臟中積累，導(dǎo)致肝臟腫大、肝細胞死亡和肝功能衰竭[13]。HBV感染能夠誘導(dǎo)肝細胞自噬反應(yīng)，但誘導(dǎo)自噬反應(yīng)的關(guān)鍵位點及具體是抑制還是激活作用目前處于探索之中。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組、HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組HepG2細胞LC3B、Beclin-1基因表達水平升高（P <0.05），P62基因表達水平降低（P<0.05）。與此同時HBX-A1762T/G1764A組LC3B、Beclin-1蛋白表達水平升高（P <0.05），P62蛋白表達水平降低（P<0.05）。提示HBX的A1762T/G1764A雙突變可能在HepG2細胞的自噬過程中起到促進作用，從而在HBV所致的HCC中起到了一定的作用。

綜上所述 HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變可能通過促進HepG2細胞的自噬，影響了肝癌細胞的細胞學(xué)功能，從而可能促進HCC的發(fā)生發(fā)展。

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基金項目：廣西自然科學(xué)基金資助（編號：2019GXNSFDA245001）