siRNA干擾下調(diào)DJ-1的表達(dá)對人支氣管上皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

魏旺麗,譚 潭,崔亞娟,劉國棟

1.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，湖南郴州 423000;2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院血液內(nèi)科,湖南長沙 410011;3.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院南院急診科，湖南郴州 423000

DJ-1又稱帕金森病相關(guān)蛋白7(PARK7)，是已知的帕金森病相關(guān)蛋白[1]，位于染色體1p36.23，相對分子質(zhì)量為20×103，長度為24 kb,屬于肽酶C56蛋白家族成員。DJ-1在很多組織中廣泛表達(dá)，如肝臟、骨骼肌、腎臟等， DJ-1作為眾所知周的致癌因子，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起著至關(guān)重要的作用[2-3]。DJ-1在很多腫瘤中都有過表達(dá)現(xiàn)象，如乳腺導(dǎo)管癌、非小細(xì)胞肺癌等[4]。DJ-1的功能很多，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激等[5]。DJ-1的抗氧化應(yīng)激功能可有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長及增殖。DJ-1是已知的肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白[6]，為研究DJ-1對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究選擇人支氣管上皮細(xì)胞(HBE細(xì)胞)作為研究對象，探討低表達(dá)DJ-1對HBE細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 實(shí)驗(yàn)室保存的HBE細(xì)胞；DJ-1 siRNA慢病毒載體、Control siRNA慢病毒載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胎牛血清(FBS)、1640培養(yǎng)基等購自美國賽默飛世爾公司。

1.2方法

1.2.1分組 構(gòu)建DJ-1基因siRNA慢病毒載體,感染HBE細(xì)胞(DJ-1 siRNA組)，并設(shè)置Control siRNA慢病毒載體對照(Control siRNA組)及空白對照(BC組)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測各周期細(xì)胞 消化收集的細(xì)胞，洗滌離心后用70%乙醇重懸細(xì)胞，制成1×106/mL的細(xì)胞懸液；于4 ℃冰箱中過夜固定后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入100 μL核糖核酸酶A(RNase A)，37 ℃水浴30 min；加入碘化丙啶(PI)染液400 μL，4 ℃避光放置30 min后采用流式細(xì)胞儀檢測各周期細(xì)胞。

1.2.3MTT比色法檢測細(xì)胞增殖情況 消化收集的細(xì)胞，梯度稀釋成1×104/mL的細(xì)胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板，共接種4塊板，每組每板接種20孔。此外，A1孔中加入200 μL完全培養(yǎng)基作為空白對照，再在其他15個空白孔中加入200 μL無菌PBS以保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。于接種后24、48、72、96 h各選1塊培養(yǎng)板進(jìn)行檢測，各實(shí)驗(yàn)孔及空白對照孔中加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h后去除孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)各150 μL，于酶標(biāo)儀上快速振蕩60 s充分溶解孔內(nèi)沉淀后，在570 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值。

1.2.4克隆形成試驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆情況 消化收集的對數(shù)生長期細(xì)胞，吹打制成單個細(xì)胞懸液，每組分別以每孔200個細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中。2周后肉眼可見的克隆出現(xiàn)后終止培養(yǎng)，棄上清液后用PBS洗滌2次,加入4%多聚甲醛2 mL放置15 min固定細(xì)胞。去固定液，吉姆薩染液染色10～30 min后流水緩慢沖洗，自然干燥。隨機(jī)選取6個視野，分別計(jì)數(shù)每個視野下單個細(xì)胞形成克隆(細(xì)胞數(shù)>5個)的數(shù)量。

1.2.5Transwell小室試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況 消化收集的對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞水平至(0.5～1.0)×106/mL。將500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基加入24孔板下室中；侵襲小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液300 μL。孵育48 h后去除侵襲小室內(nèi)未穿過基底層膜的細(xì)胞；4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色20 min；沖洗掉多余的染色液后自然干燥；隨機(jī)選取不同視野(×100)并計(jì)數(shù)細(xì)胞個數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1DJ-1下調(diào)對HBE細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，DJ-1 siRNA組、Control siRNA組、BC組細(xì)胞周期為G1期的細(xì)胞分別占65.80%、20.57%和22.44%；S期細(xì)胞分別占 16.39%、31.56%和30.35%；G2期細(xì)胞分別占17.81%、47.87%和47.21%。與Control siRNA組相比，DJ-1 siRNA組的G1期細(xì)胞比例增高45.23%,而S期和G2期細(xì)胞比例分別減少15.17%、30.06%。DJ-1 siRNA組G1期細(xì)胞比例高于BC組、Control siRNA組，S期、G2期細(xì)胞比例低于BC組、Control siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BC組、Control siRNA組各周期細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2DJ-1下調(diào)對HBE細(xì)胞增殖的影響 采用MTT比色法檢測3組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與Control siRNA組和BC組比較，DJ-1 siRNA組在接種后24、48、72、96 h的A值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。DJ-1 siRNA組在接種后48、72、96 h的增殖抑制率分別是36.9%、60.8%和37.6%。

表1 3組細(xì)胞接種后不同時(shí)間點(diǎn)A值比較

2.3克隆形成試驗(yàn)結(jié)果 采用克隆形成試驗(yàn)檢測3組單個細(xì)胞的克隆形成情況，結(jié)果顯示，DJ-1 siRNA組、Control siRNA組和BC組的克隆數(shù)分別為(8.00±1.67)、(12.50±2.17)個和(11.50±1.52)個，DJ-1 siRNA組的克隆數(shù)明顯少于Control siRNA組與BC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 3組單個細(xì)胞培養(yǎng)2周后的鏡下圖(×100)

2.4DJ-1下調(diào)對細(xì)胞遷移能力的影響 Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果顯示，DJ-1 siRNA組、Control siRNA組及BC組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(44.7±2.1)、(50.3±1.5)、(51.3±1.2)個，與Control siRNA組、BC組比較，DJ-1 siRNA組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而BC組和Control siRNA組遷移細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 3組遷移細(xì)胞鏡下圖(×100)

3 討 論

DJ-1廣泛存在于人胰腺、腎、肌肉、肝臟等多種器官及組織的細(xì)胞中。DJ-1含有189個氨基酸殘基及3個半胱氨酸(Cys)殘基，其中Cys-106為活性位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，DJ-1不僅與帕金森病密切相關(guān)，而且在很多腫瘤中都存在過表達(dá)現(xiàn)象，因此其可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[1-3]。DJ-1與肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，DJ-1是一種高度保守的蛋白，在肺鱗癌中高表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞分裂、增殖、遷移、侵襲。DJ-1的作用機(jī)制復(fù)雜，涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化應(yīng)激等多種病理、生理過程。

本研究通過下調(diào)DJ-1的表達(dá)抑制了HBE細(xì)胞的分裂、增殖、遷移、侵襲，可能涉及的DJ-1作用機(jī)制有以下幾點(diǎn)：(1)調(diào)節(jié)人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)信號通路。DJ-1可以通過抑制PTEN的活性來拮抗細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，使得PTEN/PI3K/Akt信號通路的活性增強(qiáng)[7-8]。(2)參與抗氧化應(yīng)激。DJ-1含有3個可被氧化的Cys位點(diǎn)，分別是Cys-46、Cys-53、Cys-106，其中Cys-106為活性位點(diǎn)，可被氧化突變?yōu)楸彼岷髥适Э沟蛲瞿芰?，調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)信號通路的轉(zhuǎn)錄過程，參與抗氧化應(yīng)激[9-10]。

正常的細(xì)胞周期進(jìn)程是細(xì)胞增殖的前提。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)DJ-1表達(dá)后的HBE細(xì)胞周期變化，結(jié)果表明，下調(diào)DJ-1表達(dá)后HBE細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化，細(xì)胞阻滯于G1期(與Control siRNA組相比，DJ-1 siRNA組的G1期細(xì)胞比例增高45.23%)，S期與G2期細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞有絲分裂受阻。MTT比色法檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，DJ-1 siRNA組在接種后48、72、96 h的增殖抑制率分別是36.9%、60.8%和37.6%，表明下調(diào)DJ-1的表達(dá)會抑制HBE細(xì)胞的增殖?？寺⌒纬稍囼?yàn)結(jié)果顯示，DJ-1 siRNA組的克隆數(shù)明顯少于Control siRNA組與BC組(P<0.05)，表明下調(diào)DJ-1的表達(dá)能夠抑制HBE單個細(xì)胞的克隆，進(jìn)一步證實(shí)抑制DJ-1 的表達(dá)會抑制HBE細(xì)胞增殖。結(jié)合細(xì)胞周期檢測結(jié)果，表明細(xì)胞有絲分裂受阻導(dǎo)致了細(xì)胞增殖能力減弱。Transwell小室試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與Control siRNA組、BC組比較，DJ-1 siRNA組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明下調(diào)DJ-1的表達(dá)后HBE細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力減弱。

DJ-1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長周期，在細(xì)胞的分裂、增殖、遷移、侵襲中起到了重要作用。筆者前期的研究表明，DJ-1作為促癌因子加速了細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)了肺鱗癌細(xì)胞系(SK-MES-1細(xì)胞)的侵襲與遷移[11]。結(jié)合本研究結(jié)果，表明DJ-1作為促癌因子，不僅在肺鱗癌細(xì)胞的生長、增殖過程中起作用，而且可能在HBE細(xì)胞的生長、增殖過程中也起到重要作用。目前，DJ-1的作用機(jī)制尚未完全明確，因此對DJ-1的不斷深入研究可加深人們對帕金森病以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等的認(rèn)知，為臨床治療提供新的研究方向。