液態(tài)奶中的三聚氰胺檢測(cè)方法探討液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

葉夏聲　何玉榆　黃婷　邱永為

摘? 要：本研究基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種高精密度檢測(cè)三聚氰胺的方法，并對(duì)所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察與驗(yàn)證，參考已有的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)處理步驟進(jìn)行優(yōu)化，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.998 592，方法檢出限為0.001 5 μg/kg，回收率范圍為87.79%～104.54%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.39%～5.07%。由此表明，該方法檢出限低，回收率較好，精準(zhǔn)度高，重復(fù)性好，為液態(tài)奶中的三聚氰胺檢測(cè)提供了有力的方法支撐。

關(guān)鍵詞：三聚氰胺;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;高精密度;高回收率

中圖分類號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2022）04-0098-03

三聚氰胺（melamine）（化學(xué)式為C3H6N6），相對(duì)分子量為126.12，俗稱密胺、蛋白精，國際純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（international union of pure and applied chemistry chemical nomenclature，IUPAC）命名為“1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺”，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，是有機(jī)化工業(yè)的常用材料，廣泛應(yīng)用于木材加工、化學(xué)涂料、高分子塑料等多個(gè)領(lǐng)域[1]。在傳統(tǒng)的檢測(cè)方法中，凱氏定氮法只能測(cè)定待測(cè)物的含氮量，進(jìn)而推算出其蛋白質(zhì)的含量，忽略了氮元素的來源及種類，故被非法商家利用此漏洞將三聚氰胺添加至乳制品中，塑造蛋白質(zhì)含量高的假象。此類產(chǎn)品被人食用后會(huì)嚴(yán)重影響人的身體健康，長(zhǎng)期食用可能會(huì)導(dǎo)致膀胱結(jié)石、腎結(jié)石、腎衰竭，泌尿系統(tǒng)未成熟的嬰幼兒食用后將會(huì)受到更大的影響，曾經(jīng)在社會(huì)上造成過惡劣影響[2]。在GB/T22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》中原料乳及乳制品中三聚氰胺的限量值分別為：嬰兒配方食品限量要求1.0 mg/kg;其他食品限量要求? ? ?2.5 mg/kg[3]。故研究和開發(fā)出高效的三聚氰胺檢出分析技術(shù)一直是食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

常用的三聚氰胺檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)法（ELSAE）、膠體金試紙條法、氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-gas chromatography/mass spectrometer，LC-MS/MS）等[4-8]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法將色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，既可以定性又可以定量，應(yīng)用前景廣闊[5-6]。本研究將基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），對(duì)液態(tài)奶中三聚氰胺檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步研究，優(yōu)化前處理步驟，用二乙胺乙腈水溶液作為提取液超聲提取液態(tài)奶中的三聚氰胺，離心后過濾，濾液無需凈化，用氮吹儀吹干，之后用甲醇進(jìn)行復(fù)溶。該方法不僅免除了傳統(tǒng)方法中固相萃取的繁瑣步驟，消除牛奶基質(zhì)的影響，增強(qiáng)了抗干擾能力，還降低了檢出限，提高了定量檢測(cè)的重現(xiàn)性。整個(gè)前處理步驟較為簡(jiǎn)單，節(jié)約了時(shí)間，降低了成本，實(shí)現(xiàn)了更快更準(zhǔn)地測(cè)定液態(tài)奶中三聚氰胺的含量，為液態(tài)奶的安全食用提供技術(shù)保障。

1? 材料與方法

1.1 設(shè)備與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備

試驗(yàn)所用的安捷倫1290液相色譜儀、AB Science質(zhì)譜儀、氮吹儀、混合儀、梅特勒天平、旋渦混合器、冷凍離心機(jī)、超純水儀、超聲波清洗機(jī)購自相關(guān)生產(chǎn)廠家。

1.1.2 藥品與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：三聚氰胺（德國DR公司生產(chǎn)，純度99.5%）

試劑：甲醇、二乙胺和乙腈均為德國默克產(chǎn)品（HPLC級(jí)，純度≥98%）

復(fù)溶液：甲醇/水（v/v=20∶80）

1.2 樣品準(zhǔn)備

取適量新鮮液態(tài)奶，于-20 ℃下避光? 保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)備三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱取適量，用甲醇配成10 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，? -18 ℃冰箱中保存，有效期6個(gè)月;再分別移取適量地三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g（±0.01 g）試樣，置于 15 mL刻度試管中，加入7 mL乙腈，使用渦旋儀振蕩1 min，后加入1 mL二乙胺，用水定容至10 mL，渦旋振蕩1 min，超聲提取15 min，8 000 r/min低溫離心8 min（4 ℃），過濾后備用。移取2 mL在80 ℃下氮?dú)獯蹈桑? mL的20%甲醇溶液復(fù)溶，裝瓶后供高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上機(jī)測(cè)定。

2? 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按GB/T22388—2008 《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》中的條件設(shè)置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液? ? ? ? （0.01 ?g/mL、0.05 ?g/mL、0.10 ?g/mL、? 0.20 ?g/mL、0.50 ?g/mL），待儀器平穩(wěn)后，對(duì)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制曲線，其相關(guān)系數(shù)R²=0.998 592，該曲線的R2值符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 檢出限測(cè)定

以空白牛奶樣品為基質(zhì)，一個(gè)陽性添加濃度C（10.0 ?g/g），按照上述優(yōu)化過的方法來前處理和上機(jī)，所得信噪比S/N=19.49，可計(jì)算檢出限為0.001 5 ?g/g。計(jì)算公式如下：

檢出限（method detection limit，MDL）（μg/g） =3C/（S/N）

2.3 回收率和精密度的確定

以空白牛奶作為基質(zhì)，進(jìn)行相應(yīng)的加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度為10 ?g/kg、50 ?g/kg、200 ?g/kg。每個(gè)加標(biāo)濃度分別做6個(gè)相同濃度的平行試樣，根據(jù)上述檢測(cè)方法進(jìn)行前處理和儀器測(cè)定，方法精密度和回收率結(jié)果分別見表1、表2所示。

3? 結(jié)論

本研究探索優(yōu)化了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的內(nèi)標(biāo)法測(cè)定液態(tài)奶中三聚氰胺的分析方法。該方法通過用含10%二乙胺的乙腈水溶液充分提取，取上清液進(jìn)行氮吹濃縮后，定容上機(jī)測(cè)定，最后，該方法的檢出限達(dá)到了0.001 5 μg/g，能靈敏的檢測(cè)低含量基質(zhì)，同時(shí)，液態(tài)奶試樣在按10 μg/kg、? ? ?50 μg/kg、200 μg/kg 3個(gè)濃度添加情況下，根據(jù)該試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理和儀器檢測(cè)，結(jié)果回收率為87.79%～104.54%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.39%～5.07%。該方法具有前處理簡(jiǎn)單便捷、檢出結(jié)果精密度高、定量結(jié)果準(zhǔn)確且重復(fù)測(cè)試較為穩(wěn)定等特點(diǎn)，大大提高了液態(tài)奶中三聚氰胺的檢測(cè)效率，方便對(duì)此類藥物的監(jiān)督管控，對(duì)有效的倒逼生產(chǎn)養(yǎng)殖端按規(guī)定使用該類藥物起到積極推動(dòng)作用。

參考文獻(xiàn)

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