基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討人參皂苷Rg1對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病的作用機(jī)制

周雯，周玥，李淵，韓艷軍，劉小虎

（云南大理大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，云南大理 671000）

慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）是一種多能造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的克隆性骨髓增生性疾病。CML的特征是存在BCR-ABL1融合基因，該基因編碼一個(gè)組成型活性酪氨酸激酶，能夠啟動(dòng)和維持疾病的致病驅(qū)動(dòng)因子。致使大量下游信號(hào)通路激活，從而促進(jìn)了遺傳不穩(wěn)定的髓樣細(xì)胞的不受控制地?cái)U(kuò)增[1]，最終危及生命。目前主要采用伊馬替尼等酪氨酸激酶活性抑制劑（TKIs）靶向治療，盡管效果顯著，但部分患者原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥、長(zhǎng)期器官毒性等不良反應(yīng)的出現(xiàn)限制了TKIs的臨床應(yīng)用[2]。

中藥在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中由于安全、毒副作用小，對(duì)肝腎刺激性較弱占據(jù)了重要的地位，在多部位、多靶點(diǎn)疾病的總體調(diào)控方面具有突出的優(yōu)勢(shì)。人參皂苷Rg1是三七和人參的主要活性成分，具有多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。人參皂苷Rg1可改善腸道炎癥、血管生成和放射誘導(dǎo)的腸損傷[4]。Rg1可通過激活SIRT1/TSC2信號(hào)通路抑制急性髓樣白血病的細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其衰老[5]。此外，還有抗肝纖維化、抗腫瘤、延緩衰老、改善心血管系統(tǒng)代謝等功能[6]。Rg1的抗腫瘤也多有報(bào)道，但涉及CML的較少，其作用機(jī)制并不清楚，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究Rg1作用于K562的靶點(diǎn)，為臨床研究提供新的思路。

一、研究方法

（一）人參皂苷Rg1作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“ginsenoside Rg1”，并保存其sdf格式文件。將Rg1的sdf格式文件導(dǎo)入PharmMapper平臺(tái)[7]。設(shè)置最大生成構(gòu)象為300，人類蛋白作為藥效基團(tuán)，預(yù)測(cè)人參皂苷Rg1的潛在靶點(diǎn)，利 用Uniprot數(shù) 據(jù) 庫(kù) (https：//www.uniprot.org/)的Retrieve/ID mapping 功能將靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。刪除重復(fù)基因，最終得到人參皂苷Rg1活性成分的作用靶點(diǎn)。

（二）人參皂苷Rg1和CML的交集靶點(diǎn)及互相作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“chronic myeloid leukemia”為關(guān)鍵 詞 在GeneCards疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，檢索結(jié)果以“相關(guān)分?jǐn)?shù)”進(jìn)行取值，根據(jù)中位數(shù)篩選出合適的基因數(shù)量進(jìn)行后續(xù)分析。與人參皂苷Rg1作用靶點(diǎn)通過Excel取交集，即為人參皂苷Rg1作用于CML的靶點(diǎn)。利用微生信網(wǎng)站繪制出化合物—疾病靶標(biāo)的韋恩圖。

（三）構(gòu)建化合物—疾病蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇研究物種為“智人”，最低相互作用域值設(shè)為highest confidence≥0.4，隱藏游離靶點(diǎn)，獲得靶點(diǎn)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖，保存csv格式文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

（四）化合物—疾病之間分子對(duì)接驗(yàn)證

利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)查找MAPK1(ERK)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，將Rg1的Mol2結(jié)構(gòu)式與蛋白晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock vina、Pymol軟件中，檢測(cè)疾病靶蛋白與小分子化合物之間結(jié)合能力。

（五）Western blotting檢測(cè)p-ERK蛋白的表達(dá)

取2×106個(gè)K562放 入 培 養(yǎng)瓶，加入500μL 20μmol/L的Rg1，總液體體積為5mL Rg1濃度、時(shí)間篩選參考本課題組以往研究結(jié)果[8]。提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定總蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入p-ERK一抗4℃過夜，TBST緩沖液漂洗2次，加入二抗，室溫反應(yīng)2h，ECL增強(qiáng)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

二、結(jié)果

（一）Rg1作用于CML的蛋白靶點(diǎn)

在PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)得到299個(gè)人參皂苷Rg1的作用靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)去重后，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換后、剔除重復(fù)基因、無(wú)效基因名得到290個(gè)有效靶點(diǎn)。

（二）CML相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建及交集靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到4560個(gè)CML的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，根據(jù)“相關(guān)性得分”的中位數(shù)進(jìn)行篩選，經(jīng)三次取中位數(shù)后，最終將1141個(gè)靶基因納入考慮范圍。取人參皂苷Rg1和CML的靶點(diǎn)交集共得到93個(gè)疾病靶點(diǎn)，制韋恩圖，見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1于CML相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

（三）人參皂苷Rg1作用于CML的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

人參皂苷Rg1與CML的蛋白互做分析，見表1、圖2。該網(wǎng)絡(luò)共包含93個(gè)節(jié)點(diǎn)，333條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為7.16，平均局部聚類系數(shù)為0.476。節(jié)點(diǎn)面積越大，顏色越亮代表度值越大。度值表示該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，度值越大表明該靶點(diǎn)與其他作用靶點(diǎn)聯(lián)系越緊密，在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。該93個(gè)共同靶點(diǎn)是Rg1作用于疾病的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。其中SRC（癌基因酪氨酸蛋白激酶），MAPK1（絲裂原激活的蛋白激酶1），PIK3R1（磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基α），GRB2（生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2），HRAS（GTPase HRas），PTPN11（酪氨酸蛋白磷酸酶非受體11型），LCK（酪氨酸蛋白激酶），MAPK8（裂原激活的蛋白激酶8），IGF1（胰島素樣生長(zhǎng)因子I）等度值排行前10的靶點(diǎn)均可與17個(gè)及以上靶點(diǎn)相互聯(lián)系，提示這些靶點(diǎn)在治療方面的重要性。

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

表 1 人參皂苷Rg1對(duì)AD作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)分析（前20位）

（四）分子對(duì)接結(jié)果

人參皂苷Rg1與MAPK1（ERK）進(jìn)行對(duì)接，結(jié)合能為-7KJ/mol，一般認(rèn)為配體與受體的結(jié)合能越低，其結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生的作用可能性越大。結(jié)合能小于0KJ·mol-1說明受體和配體可自發(fā)結(jié)合。見圖3。

圖3 分子對(duì)接

（五）Rg1對(duì)562細(xì)胞p-ERK相對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

與對(duì)照組相比，Rg1組p-ERK蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 Rg1對(duì)562細(xì)胞p-ERK蛋白表達(dá)量的影響與對(duì)照組相比（P＜0.01）

三、討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，探討了人參皂苷Rg1對(duì)CML的潛在作用機(jī)制。推測(cè)可能通過SRC、MAPK1、PIK3R1、GRB2、HRAS、PTPN11等度值排名較高的靶蛋白發(fā)揮治療CML的作用。

SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）是非受體蛋白酪氨酸激酶，在腫瘤的遷移中起到重要重用[9]。粘著斑（FAs）的周期性形成和分解是腫瘤細(xì)胞遷移的基礎(chǔ)。SRC已被證實(shí)為CML中的治療靶點(diǎn)[10]。因此我們選擇MAPK1（ERK）進(jìn)行研究，MAPK1（絲裂原激活的蛋白激酶1），屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞骨架重排來介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，例如細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、轉(zhuǎn)移和分化。李剛等研究表明，TUG-1可通過miR-370-3p/MAPK1/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)AML（急性髓樣白血病）細(xì)胞的遷移和侵襲能力[11]。分子對(duì)接后證明Rg1能與此靶點(diǎn)蛋白自發(fā)結(jié)合。本課題組證明Rg1作用于K562細(xì)胞后能抑制其增殖，但具體機(jī)制尚不完全清楚，本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)后找出潛在靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，western blotting結(jié)果顯示，Rg1組p-ERK的表達(dá)明顯降低，提示Rg1可以通過抑制p-ERK起到抗腫瘤的作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究人參皂苷Rg1通過多靶點(diǎn)和多通路作用于白血病的分子機(jī)制。除了已知的靶點(diǎn)和通路，還挖掘出潛在的作用靶點(diǎn)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)。