術前碳水化合物負荷對脾切除老年大鼠術后認知功能的影響

左友波，楊秋燕，趙蕾，楊宇焦

(川北醫學院附屬醫院麻醉科，四川 南充 637000)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是術后常見的腦部并發癥，主要表現為定向障礙、記憶障礙、注意力不集中、精神錯亂、學習和溝通能力下降等。目前隨著老年人群的不斷增加，老年手術患者也不斷增多，POCD發生率并未隨技術的進步而下降，甚至呈升高趨勢[1]。POCD使患者術后恢復延遲，術后并發癥增加，致殘率和死亡率增加[2]。多學科專家命名共識工作組于2018年將POCD更名為圍手術期神經認知障礙(perioperative neurocognitive disorders，PND)，臨床研究方法得到改變，但基礎研究方法并未改變[3]，POCD的防治依然是當前的研究難點和熱點。手術應激反應使機體產生術后胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和促使炎癥因子釋放，而IR和炎癥反應是POCD的重要機制。有研究[4-6]顯示，術后IR和炎癥因子的釋放與術后認知功能下降密切相關。還有研究[7-9]顯示，術前2～4 h口服碳水化合物可以減輕術后IR及炎癥反應、促進術后快速康復等。然而，術前碳水化合物負荷對術后認知功能影響的研究報道甚少。本研究旨在通過對脾切除老年大鼠術前進行碳水化合物經口負荷建立動物模型，探討術前碳水化合物負荷對術后胰島素抵抗、炎癥因子和學習記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用20～22月齡SPF 級雄性SD大鼠60只，體量500～700 g，均由川北醫學院動物實驗中心生產與提供，實驗動物生產許可證號：scxk(川)2013-18。所有大鼠飼養于標準鼠籠，不間斷供給水和正常標準飼料，控制溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，光照周期12/12 h光/暗循環。實驗及實驗操作方法按相關倫理及指南要求進行。

1.1.2 主要儀器與試劑 體重秤，血糖儀(2310NZ型，三諾生物傳感股份有限公司)，臺式低速離心機(2D-5型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，酶標儀(KHB ST-360型，上海科華實驗系統有限公司)，Morris水迷宮及分析軟件(WMT-100S型，成都泰盟軟件有限公司)，胰島素 ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6的ELISA 試劑盒(均購自博士德生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 所有大鼠進行適應性喂養7 d，按體重進行排序編號，并采用隨機數字表將其分為對照組(C組)、禁食禁飲組(FAST組)和碳水化合物組(CHO組)，每組各20只。C組不進行禁食和手術干預；FAST組大鼠先禁食禁飲14 h，再行腹腔麻醉下脾臟切除術；CHO組大鼠在脾切除術前3 h經口飲用12 mL 碳水化合物溶液(宜昌人福藥業有限責任公司，商品名：術能)，包含碳水化合物14.2 g/100 mL、維生素B1、維生素B6和維生素B12等成分。

1.2.2 脾切除術 麻醉方法采用腹腔內注射1%戊巴比妥鈉35 mg/kg，待大鼠反射消失后備皮，并仰臥位固定于帶有恒溫加熱墊的動物手術板上。消毒鋪巾，靠左側取旁正中切口，長約2 cm。暴露肝、胃和網膜等組織。探查找出脾臟，并輕輕牽拉出腹腔。分離脾臟血管，用無菌縫線結扎各分支血管，用剪刀緊靠脾臟處離斷血管和韌帶，移除脾臟，觀察出血點并止血。腹腔沖洗后復位腹腔內其它組織，在切口處使用抗生素粉劑預防感染。縫合腹膜后，0.25%的布比卡因浸潤切口用于術后鎮痛，再逐層縫合肌層和皮膚。術后暖風保暖，蘇醒后單獨飼養。

1.2.3 水迷宮實驗 認知功能檢測使用Morris水迷宮(水池直徑120 cm、高50 cm)。術后先進行定位航行實驗訓練，訓練結束后進行空間探索實驗，檢測學習記憶功能。實驗時池水深達平臺上2 cm，水溫維持(22±2)℃。用少量黑色墨汁使池水變為黑色。池壁四周貼上不同圖案作為大鼠尋找路線的參照物。平臺固定放置于東、南、西、北中的一個象限的中央。定位航行實驗：由固定人員從四個不同象限同一位置將大鼠沿著池壁輕輕放入池中。使用水迷宮自帶攝像系統觀察記錄大鼠的在泳池的游動路徑和潛伏期等指標。設置大鼠尋找隱匿平臺(潛伏期)的最長時間為60 s，滯留平臺時間15 s。各組大鼠各取10只，在術后第2天開始進行連續5 d的定位航行訓練實驗， 4次/d(C組與手術大鼠同步進行實驗)。定位航行實驗完成后，進行空間探索實驗。撤出平臺，其他場景與定位航行實驗相同，探索時間設置60 s，將大鼠從原平臺象限的對側象限沿池壁輕輕放入。記錄大鼠在原平臺象限滯留時間和穿越原平臺位置次數。

1.2.4 標本采集與檢測 各組大鼠在術后第1天各取10只，腹腔內注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深度麻醉，待反射消失后，快速剪刀暴露一側股動脈并放血，用肝素抗凝管采集血液標本，離心15 min，獲取上清液，用羅氏血糖儀測量血葡萄糖濃度，剩余標本用1 mL EP管分裝，-80 ℃深低溫冰箱保存。采用ELISA法檢測血漿中胰島素、TNF-α、IL-1β和IL-6水平。根據葡萄糖(FBG)和胰島素(FBI)水平，計算胰島素抵抗指數(insulin resistance index,IRI)[IRI=(FBG×FBI)/22.5(FBG單位為mmol/L；FBI單位為mIU/L)]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 術前碳水化合物負荷對脾切除老年大鼠術后認知功能的影響

術后1 d，3組大鼠訓練逃避潛伏期比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但逃避潛伏期隨訓練天數的增加逐步縮短。術后6 d，大鼠逃避潛伏期FAST組>CHO組>C組(P<0.05)。見表1。空間探索實驗結果顯示， FAST組大鼠較C組的目標象限停留時間較短，穿越平臺次數較少；與FAST組比較，CHO組大鼠目標象限停留時間較長，穿越平臺次數較多(P<0.05)。見表2。

表1 3組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較

表2 3組大鼠空間探索實驗結果的比較

2.2 術前碳水化合物經口負荷對老年大鼠術后胰島素抵抗的影響

術后1 d，，與C組比較，FAST組大鼠血漿葡萄糖、胰島素水平及IRI較高(P<0.05)；與FAST組比較，CHO組大鼠血漿葡萄糖、胰島素水平及IRI較低(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠血漿葡萄糖、胰島素、IRI比較

2.3 術前碳水化合物經口負荷對老年大鼠術后炎癥反應的影響

術后1 d，3組大鼠血漿TNF-α水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與C組比較，FAST組大鼠血漿IL-1β和IL-6水平較高(P<0.05)；與FAST組比較，CHO組大鼠血漿IL-1β和IL-6水平較低(P<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

3 討論

學習和記憶功能是認知功能的兩個核心內容，Morris水迷宮(MWM)常用于評估大鼠或小鼠空間學習和記憶能力[10]。本研究顯示，禁食禁飲組大鼠在術后第6天逃避潛伏期明顯較長，空間探索實驗中有較短的目標象限停留時間及較少的平臺穿越次數；而術前碳水化合物經口負荷組大鼠實驗結果較禁食禁飲組大鼠好(P<0.05)，但與正常對照組大鼠比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明手術創傷和禁食禁飲損害了老年大鼠的學習和記憶功能，術前碳水化合物經口負荷可以預防手術和禁食帶來的認知損害。

多維碳水化合物是一種含單糖、多糖和多種維生素的飲料，碳水化合物含量14.2 g/100mL。本研究碳水化合物選定的劑量為相當人體攝入50 g碳水化合物，相當于人類的標準早餐促進胰島素釋放劑量[11]。既往綜述及Meta分析[12-13]顯示，術前口服碳水化合物能減輕術后IR。另有研究[8,14-16]發現，術前口服碳水化合物可以降低手術炎癥反應，使術后TNF-α、IL-6水平降，促進GLP-1的釋放等。本研究結果也顯示，腹腔麻醉下的脾切除術和長時間的禁食禁飲使大鼠產生了術后胰島素抵抗和炎癥因子水平表達的增高，而術前碳水化合物經口負荷則改善了脾切除大鼠術后胰島素抵抗，并使術后IL-1β和IL-6表達水平降低。

雖然術后認知功能下降的機制未完全明確，但不少研究[4,17-18]顯示，術后認知功能的改變與術后胰島素抵抗、炎癥反應的程度等明顯相關。圍術期炎癥反應是PND發生的重要機制，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子在腦組織和外周血中的表達水平均與PND的發生有著良好聯系[18]。TNF-α和IL-1β水平升高可引起炎癥級聯反應，并使IL-6升高。IL-6水平與組織損傷呈正相關，并與認知功能損傷有關。麻醉和手術可以導致炎癥因子的釋放和血腦屏障受損，外周血中的炎癥因子進一步使血腦屏障受損并透過血腦屏障產生中樞神經系統炎癥，持續和嚴重的炎癥反應導致PND的發生。同時，胰島素抵抗是認知功能障礙的重要因素，糖尿病是老年癡呆的重要原因。并且炎癥因子與胰島素抵抗互為影響，IL-6水平與術后胰島素抵抗存在正相關[19]。術后胰島素抵抗與炎癥反應互為因果，導致炎癥反應和胰島素抵抗同時升高。王培培等[20]研究顯示，減輕外周血中炎癥反應可以改善老年髖關節置換術患者術后神經認知障礙。本研究也顯示實驗大鼠術后學習記憶功能的改變與胰島素抵抗和炎癥反應的改變存在相關性。

綜上，術前碳水化合物經口負荷可以預防脾切除老年大鼠認知功能的損害，可能與其改善術后胰島素抵抗，下調炎癥因子表達有關。