基于高通量測序數據挖掘探討小鼠射血分數保留心力衰竭的發病機制

尤紅俊,趙倩倩,任淑婷,刁佳宇,茍棋玲,董夢雅

射血分數保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)是一種除以高血壓、心肌肥厚和舒張功能障礙為特征的血流動力學紊亂之外,伴肥胖癥和糖尿病等參與的多系統綜合征,涉及心、肺、腎、骨骼肌、脂肪組織、血管系統、免疫和炎癥反應等。隨著人均壽命延長,迄今為止其占心力衰竭總人群近2/3[1]。目前,心肌肥厚、心肌纖維化、興奮性收縮偶聯缺陷、肌節功能障礙、氧化-氮化應激、微血管功能不全、炎癥、線粒體和代謝缺陷等多因素被認為可能參與HFpEF 病理生理學過程[2]。因相關的并存疾病引起的表型復雜,其病理生理機制仍不甚清楚,故也缺乏針對病因及機制的有效治療措施,其死亡率仍偏高,2 年內全因死亡率約35%,造成嚴重的社會經濟學問題[3]。因而,探討其發病機制將有助于臨床診療工作。

既往關于HFpEF 的基礎研究多基于高血壓、糖尿病或高齡等單一因素誘導的心臟舒張功能障礙;而高脂飲食聯合血管緊張素Ⅱ雙重因素誘導的HFpEF 動物模型,可更近似模擬人群HFpEF 的復合表型,如糖脂代謝紊亂、氧化/氮化應激等,且其機制探索性研究尚未見報道。本研究基于基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO)來源的HFpEF 模型小鼠左心室組織轉錄組高通量測序數據,應用生物信息學手段,尋找疾病差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡,鑒定核心基因,再進行富集分析及疾病關聯性分析,探討HFpEF 發病機制,從而為疾病診療提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 數據下載 在GEO 數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO)[4-5]中搜索“HFpEF”,獲取高通量轉錄譜測序數據集GSE153923,其來源于荷蘭赫布雷希特研究所發育生物學和干細胞研究系,由Withaar 等[6]研究者提供。該數據集以高脂飲食聯合血管緊張素Ⅱ干預雌性C57BL/6J 小鼠(18～22 月齡)構建HFpEF 模型,作為實驗組(樣本量為4),以月齡、體重匹配的雌性小鼠低脂飲食飼養作為對照組(樣本量為4),取左心室組織標本進行轉錄組測序分析。采用GPL19057 Illumina NextSeq 500(Mus musculus)平臺。

1.2 差異表達基因分析 采用統計軟件R 語言(版本R 4.1.1)“DESeq2”包[7]進行基因差異表達分析。以|log fold change|≥1,adjustedP＜0.05 為DEGs 的篩選條件,以R 語言“ggplot2”包(https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/)繪制火山圖以可視化DEGs。

1.3 PPI 網絡分析 將DEGs 導入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,http://string-db.org/cgi/input.pl)進行PPI 網絡分析[8]。設定可信度(confidence)為0.4,輸出TSV 格式文件,用于后續Cytoscape 分析篩選核心基因[9]。

1.4 核心基因鑒定 使用Cytoscape 3.7.3 軟件插件CytoHubba (http://hub.iis.sinica.edu.tw/cytohubba/)篩選出PPI 網絡中的核心基因[10]。拓撲評分策略之一Degree 代表基因/蛋白間相互作用關系連通度,以Degree值排序前30 位的基因作為PPI 網絡中的核心基因。

1.5 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 使用R 語言對DEGs 和核心基因分別進行GO(http://www.geneontology.org)和KEGG通路富集分析[11-12]。GO 富集分析分別在生物學過程(biological processes,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3 個方面對基因進行功能注釋[13]。利用R 語言“ggplot2”包將結果可視化。P＜0.05 被認為差異有統計學意義。

1.6 核心基因與心力衰竭(舒張性)的相互作用 利用比較毒理基因組學數據庫(Comparative Toxicogenomics Database,CTD,http://ctdbase.org/)的數據分析核心基因與心力衰竭(舒張性)風險之間的關系。CTD 整合了包括化合物-基因/蛋白質相互作用、化合物-疾病和基因-疾病關系在內的信息,以探索與疾病發病機制相關的假設[14]。

2 結 果

2.1 基因差異表達分析 以Log(fold change)≥1,adjustedP＜0.05 為標準,與對照組比較,HFpEF 小鼠左心室組織中337 個基因存在差異表達,其中,212個表達上調,125 個表達下調。基因差異表達譜的火山圖見圖1。

圖1 差異基因表達譜的火山圖

2.2 DEGs 富集分析 DEGs GO 富集分析提示,在BP 方面,DEGs 主要參與細胞外結構和基質的構成、損傷應答和愈合、膠原纖維構成、血液凝固和細胞趨化性等;在CC 方面,DEGs 主要參與細胞外基質、含膠原的細胞外基質、細胞外基質成分、膠原三聚體和帶狀膠原纖維等;在MF 方面,DEGs 主要參與細胞外基質結構成分、糖胺聚糖結合、受體配體活性、纖連蛋白結合和肝素結合等。詳見圖2。

圖2 DEGs GO 富集分析部分可視化(氣泡圖)

DEGs KEGG 富集分析提示,DEGs 參與細胞外基質-受體相互作用、黏著斑、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、血小板活化、糖尿病并發癥中的晚期糖化終產物(AGEs)及其受體(RAGE)、缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF)1 等信號通路中。詳見圖3。

圖3 DEGs KEGG 富集分析部分可視化(氣泡圖)

2.3 PPI 網絡及核心基因鑒定 對337 個DEGs 采用STRING 在線數據庫進行PPI 網絡分析,構建PPI 網絡,隱去離散節點后,所構建的PPI 網絡中節點(蛋白數)321 個、邊數(蛋白間作用關系)1 183 條,平均節點度值為7.37,PPI 富集P值＜1.0e-16。輸出TSV 格式文件并導入Cytoscape 軟件,進行cytoHubba 運算,篩選出Degree 值排名前30 位及與其直接作用的節點,構成子網絡,節點數為128 個,邊數為998 條,詳見圖4。Degree 值排名前30 位的鑒定為核心基因,即Fn1、Mki67、Mmp9、Col1a1、Ctgf、Col1a2、Col3a1、Timp1、Cdk1、Hmmr、Foxm1、Racgap1、Ckap2、Spag5、Ncapg、Cenpe、Fbn1、Spp1、Thbs1、Shcbp1、Cdca3、Ckap2l、Tpx2、Cenpf、Kif20a、Cep55、Prc1、Ect2、Lox 和Anln。

圖4 DEGs 構成的PPI 網絡中鑒定核心基因

2.4 核心基因富集分析 核心基因GO 分析提示,BP方面,顯著富集的子集包括有絲分裂、胞質分裂和細胞骨架依賴性胞質分裂等;CC 方面,核心基因主要參與構成有絲分裂紡錘體、含膠原的細胞外基質和細胞外基質等;在MF 方面,主要參與微管結合、細胞黏附分子結合和賦予拉伸強度的細胞外基質結構成分等。詳見圖5。

圖5 核心基因GO 富集分析部分可視化(氣泡圖)

核心基因KEGG 富集分析提示,核心基因參與細胞外基質-受體相互作用、黏著斑、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE、PI3K-Akt、血 小 板 活化、轉化生 長 因 子(TGF)-β和p53 等信號通路中。詳見圖6。

圖6 核心基因KEGG 富集分析部分可視化(氣泡圖)

2.5 核心基因與心力衰竭(舒張性)的相互作用關聯性分析 本研究利用CTD 數據庫分析核心基因與心力衰竭(舒張性)風險之間的關系。核心基因與心力衰竭(舒張性)的相互作用關聯性分析所示,Col1a1、Fn1、Mmp9、Timp1、Spp1、Col3a1、Cdk1 和Thbs1 等與心力衰竭(舒張性)關聯性評分較高。詳見圖7。

圖7 CTD 數據庫中核心基因與心力衰竭(舒張性)關聯性評分

3 討 論

HFpEF 是一種表型極其復雜的疾病綜合征,涉及炎癥、氧化應激、心肌肥厚/纖維化、代謝紊亂等,病理機制研究仍不甚透徹,且缺乏特效治療。故進一步探索其致病機制有著深遠的意義。本研究基于GEO 數據進行生物信息學分析,有助于為疾病的防治提供理論支持。

HFpEF 的發生發展涉及多種基因表達調控失衡。本研究發現HFpEF 小鼠心肌組織中337 個基因表達存在顯著性差異。富集分析提示DEGs 在細胞外結構和基質的構成、損傷應答和愈合、膠原纖維構成、血液凝固、細胞趨化性、膠原纖維、糖胺聚糖結合、受體配體活性、纖連蛋白結合和肝素結合等不同GO 子集方面發揮重要作用。KEGG 提示DEGs 參與細胞外基質-受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt、血小板活化、AGERAGE、HIF-1 等。在HFpEF 中,內皮細胞在炎癥、應激或損傷刺激下可分泌促炎因子,促進單核細胞黏附、遷移及分化為巨噬細胞。而巨噬細胞可分泌多種介質和促炎細胞因子驅動靜止的成纖維細胞轉化為增殖和基質合成活躍的肌成纖維細胞,后者持續激活產生細胞外基質蛋白如膠原蛋白等,促使心肌肥大僵硬而出現舒張性功能障礙。本研究分析發現,DEGs 參與這些生物學過程及細胞外基質-受體相互作用、黏著斑信號通路,與HFpEF 病理生理學過程相符合。同時,PI3K-Akt 通路在HFpEF 中激活,PI3K-Akt 在調節心肌細胞生長、心肌血管生成和細胞死亡中起重要作用。胰島素樣生長因子1(IGF1)-PI3K-Akt 信號通路在調節運動誘導的生理性心臟肥大和心臟保護中發揮關鍵作用[15];增加的PI3K 活性對心臟功能和纖維化有利并削弱病理性生長[16]。也有研究發現,通過主動脈橫向縮窄建立的兔舒張性心力衰竭模型中,黏著斑和PI3K-Akt 通路被激活[17];在高脂聯合N-ω-硝基-l-精氨酸甲酯(L-NAME)飼養誘導的HFpEF 小鼠模型甲基化研究中,PI3K-Akt 信號通路同樣被激活[18],這些進一步證實了本研究分析結果的可靠性及PI3K-Akt 信號通路在HFpEF 發生發展中的重要作用。心力衰竭是一種促血栓狀態,心力衰竭病人血小板及血管對一氧化氮(NO)的應答被削弱;與健康個體相比,NO 供體硝普鈉對血小板聚集的抑制在HFpEF-心房顫動病人中受損[19]。HFpEF 多伴有肥胖、糖尿病等表型,兩者都可能導致炎癥和纖維化心房和心室肌病的發展,是全身性血栓栓塞的危險因素[20]。經分析提示HFpEF 小鼠DEGs 參與血液凝固、血小板活化通路,該通路中富集的 DEGs 可能在 HFpEF 血栓事件中起作用。HFpEF 血糖代謝異常,晚期糖化終產物在體內積聚并作用于受體,促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化,進而觸發下游細胞外基質的重塑、炎癥和氧化應激等一系列病理過程[21]。富集于AGE-RAGE 信號通路中的DEGs 可能影響HFpEF 的進程。HIF-1α是一種高度保守的轉錄因子,在組織對缺氧的反應中起關鍵作用,在肥胖病人的脂肪組織中表達增加,導致膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和賴氨酰氧化酶等促纖維化轉錄程序上調;HIF-1α也可介導肥胖相關炎癥的M1 巨噬細胞募集,釋放炎性細胞因子,并增加膠原蛋白、TGF-β和結締組織生長因子等的表達。這些綜合因素加速心臟纖維化并損害心臟舒張功能;而抑制高脂飲食小鼠脂肪組織中HIF-1α的表達可抑制纖維化并減少脂肪組織中的炎癥[22]。本研究發現DEGs 參與HIF-1 通路,提示HIF-1α通路可能是促成HFpEF 的關鍵環節。

為進一步剖析DEGs 在HFpEF 發病機制中的作用,本研究構建PPI 網絡,篩選出核心基因,即Fn1、Mki67、Mmp9、Col1a1、Ctgf、Col1a2、Col3a1、Timp1、Cdk1、Hmmr、Foxm1、Racgap1、Ckap2、Spag5、Ncapg、Cenpe、Fbn1、Spp1、Thbs1、Shcbp1、Cdca3、Ckap2l、Tpx2、Cenpf、Kif20a、Cep55、Prc1、Ect2、Lox 和Anln。并對核心基因進行富集分析。研究表明,持續的壓力導致心臟重塑,其中,心肌細胞死亡超過更新,導致進行性心力衰竭;在多數情況下,心肌細胞中的有絲分裂可能代表干細胞的成熟后代;心肌細胞更新可能主要由內源性心臟干細胞和血源性干細胞介導,但這種生物學現象的能力有限[23]。核心基因參與有絲分裂胞質分裂,提示可能為心肌損傷后代償。核心基因參與細胞外基質、微管結合、細胞黏附分子結合和賦予拉伸強度的細胞外基質結構成分等,與之前的分析符合,提示HFpEF 中存在活躍的結構重塑。與DEGs 通路富集相比,核心基因還參與TGF-β等信號通路中。TGF-β信號通路在心力衰竭發生發展中有著極其重要的作用。在HFpEF 中,TGF-β信號傳導參與病理性肥大和纖維化的發展。核心基因Thbs1 和Fbn1 參與該通路。Thbs1 是TGF-β通路激活的關鍵調節因子,體外實驗已證明,miR-221 可靶向抑制Thbs1 蛋白表達,進而抑制TGF-β信號通路的激活,削弱肌成纖維細胞活化、膠原蛋白分泌和心肌纖維化[24],提示該基因可能作為HFpEF 的治療靶點。Fbn1 家族包括潛在的TGF-β結合蛋白等成員,在體外控制TGF-β1的釋放、靶向和激活,并且還作為富含原纖維蛋白的微纖維的結構成分發揮作用[25],在動脈損傷應答中起關鍵作用,但其在HFpEF 中的作用尚未見報道。

本研究還利用CTD 數據庫將核心基因與心力衰竭(舒張性)的相互作用進行關聯性分析,關聯性評分較高的為Col1a1、Fn1、Mmp9、Timp1、Spp1、Col3a1、Cdk1 和Thbs1 等。這些基因單一或多個同時參與細胞外基質-受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt、血小板活化、AGE-RAGE、血小板活化、HIF-1 等信號通路中,與心力衰竭發生相關。Hua 等[26]發現Col1a1 可能是心力衰竭的血漿生物標志物,與心力衰竭進展相關,且可預測從心力衰竭發病到心臟移植后1 年生存率。通過腹主動脈縮窄構建的小鼠壓力過載性舒張性心力衰竭中,氧化還原失衡,基質金屬蛋白酶(MMP)-2/9 的表達活性增加,膠原蛋白Col1a1 降解增加,從而誘發心力衰竭;而MMP 對Col1a1 基因的切割位點發生突變后可改善上述病理狀態[27]。纖連蛋白(Fn1 編碼)和膠原蛋白alpha-1(Ⅲ)鏈(Col3a1 編碼)均屬于細胞外基質成分;在壓力過載性小鼠模型中使用骨橋蛋白(Spp1 編碼)治療可預防心肌細胞肥大和心臟纖維化,阻斷PI3K-Akt 通路磷酸化,降低纖連蛋白和膠原蛋白alpha-1(Ⅲ)鏈等的表達,預防心力衰竭[28]。金屬蛋白酶組織抑制劑1(Timp1 編碼)是MMPs 的特異性抑制劑,與MMPs 共同作為細胞外基質組成的關鍵調節劑,由于其動態活性,可作為HFpEF 心肌纖維化及心臟功能的預后指標[29]。重塑特異性標志物骨橋蛋白(Spp1 編碼)可預測HFpEF 病人18 個月時的全因死亡率和/或心力衰竭相關再住院率[30]。氧化應激是HFpEF 的表型之一,其誘導心肌細胞周期停滯,導致心肌細胞丟失;而補充硒劑可通過激活PI3K-Akt 通路使細胞周期蛋白依賴性激酶1(Cdk1 編碼)表達增加,削弱氧化應激對心力衰竭的影響。其余核心基因也可能涉及HFpEF 發病機制,值得進一步探討。

綜上所述,本研究基于轉錄譜數據挖掘進行研究,有助于進一步了解HFpEF 發病機制,為疾病防治及后續科研提供一定的理論支持。但本研究也存在一定局限性,比如未能針對某一功能集或通路內的DEGs 進一步深度探討,這也是后續研究的方向。另外,HFpEF差異表達基因豐富,DEGs 參與眾多生物學功能和/或信號通路,本研究未能針對所有DEGs 及可能涉及的機制展開討論。