梓醇-川芎嗪方對阿爾茨海默病模型小鼠的作用及對水通道蛋白4 表達的影響

鄧楚珺,孟勝喜,陳慧澤,王 兵,郭起浩,付劍亮

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種嚴重危害人類健康的神經系統退行性疾病,給病人家庭及社會均造成了較大的經濟負擔和照顧負擔[1]。作為膜轉運蛋白的水通道蛋白4(AQP4)通過β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)清除[2]、突觸可塑性[3]、谷氨酸穩態[4]、離子穩態[5]、神經炎癥[6]等方面對AD 發生、發展起著重要的作用。本課題組前期的研究已經發現,梓醇-川芎嗪方(CT 方)具有提高AD 模型小鼠認知功能的作用[7]。為了進一步驗證梓醇-川芎嗪方對AD 的作用,并探討其對AQP4 表達的影響,故開展本試驗。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 非特定病原體(SPF)級、雄性、β-淀粉樣前體蛋白 swe 基因/早老蛋白 1dE9 基因(APPswe/PS1dE9)雙轉基因小鼠50 只,6 月齡,按照隨機數字表法分為模型組、鹽酸多奈哌齊片(安理申)組、梓醇-川芎嗪方低劑量組(CT-L 組)、梓醇-川芎嗪方中劑量組(CT-M 組)、梓醇-川芎嗪方高劑量組(CT-H組),每組均為10 只。另選10 只同月齡C57BL/6J 小鼠作為對照組。以上動物均購自北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(京)2018-0006。以上動物飼養環境均為溫度(23±2)℃、濕度(55±5)%、明暗循環為12 h,自由進食和飲水。

1.2 藥物、試劑及儀器 梓醇-川芎嗪方是由4.274 mg 的梓醇和1.554 mg 的川芎嗪組成。梓醇,CAS 號:2415-24-9,分子式:C15H22O10,分子量:362.33,純度≥98.0%,Batch No.DSTDZ000502。川芎嗪,CAS 號:1124-11-4,分子式:C8H12N2,分子量:136.19,純度≥98.0%,Batch No.DST200602-032,以上均由上海滬崢生物科技有限公司提供。鹽酸多奈哌齊片,規格:每片5 mg,商品名:安理申,國藥準字:H20200978,lot:1705080,由衛材(中國)藥業有限公司提供。

Morris 水迷宮(Morris water maze,MWM),型號JLBehv-MWMG-1,購自上海吉量軟件科技有限公司。AQP4 多克隆抗體(lot:PB0500)及羊抗兔抗體(lot:KGAA35)購自美國Boster Biological Technology 公司。丙二醛(MDA,lot:A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD,lot:A001-3-2)、過氧化氫酶(CAT,lot:A007-1-1)、總抗氧化能力(T-AOC,lot:A015-2-13),以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,lot:AF7021)購自美國Affinity 公司。可溶性Aβ1-40試劑盒(lot:ZK-02895)、可溶性Aβ1-42試劑盒(lot:KB38007)、不可溶性Aβ1-40試劑盒(lot:ZK-H738)、不可溶性Aβ1-42試劑盒(lot:KB1200A)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥 CT-L 組、CT-M 組及CT-H 組小鼠每日給予相對應劑量的梓醇-川芎嗪方灌胃,安理申組小鼠每日給予安理申灌胃。梓醇-川芎嗪方低劑量、中劑量、高劑量及安理申溶液給藥濃度依據人和動物體表面積折算系數換算[8],經過計算:梓醇-川芎嗪方低、中、高劑量給藥濃度分別為25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg,安理申溶液給藥濃度為5 mg/kg。對照組和模型組小鼠每天給予等體積的生理鹽水灌胃,各組均為每日1 次,連續灌胃8 周。

1.3.2 Morris 水迷宮行為學測試 干預8 周后,各組小鼠均進行Morris 水迷宮行為學測試,包括定位航行實驗和空間探索實驗。①定位航行實驗:此實驗進行5 d。Morris 水迷宮水池分為4 個象限,逃生平臺放在其中1 個象限內。小鼠被面向池壁放入水中,其在120 s 內找到平臺的時間為逃逸潛伏期(escape latency,EL)。若小鼠在120 s 內未找到平臺,逃逸潛伏期則計為120 s。每次從不同的象限將小鼠面向池壁置入水中,共觀察5 d。記錄各組小鼠的逃逸潛伏期、游泳距離(swimming distance,SD)。②空間探索能力(space exploration capability,SEC):撤去平臺,固定入水點,小鼠在水中游泳120 s,記錄小鼠找到原平臺的路線,記錄首次到達原平臺時間(time of first arrival at the platform,TFAP)和120 s 內穿越原平臺的次數(number of crossing platforms,NCP)。

1.3.3 標本留取 在完成Morris 水迷宮行為學測試后,取小鼠的外周血,然后以4 ℃、3 000 r/min 離心20 min,取其上清。以10%水合氯醛深度麻醉后進行解剖實驗,留取小鼠的腦組織等標本,存放于-80 ℃冰箱中。后續則用以上標本進行相關的觀察和檢測。

1.3.4 MDA、SOD、CAT 及T-AOC 水平測定 以二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定小鼠海馬體中蛋白濃度,硫代巴比妥酸法測定小鼠海馬體和血清中MDA 水平,水溶性四氮唑(WST-1)法測定小鼠海馬體和血清中SOD 水平,鉬酸銨法測定小鼠海馬體和血清中過氧化氫酶水平,比色法測定海馬體和血清中T-AOC。以上檢測均嚴格按照各種試劑盒說明書的步驟進行操作。

1.3.5 腦內Aβ水平的測定 將各組小鼠大腦皮層組織的勻漿分別加入可溶性Aβ1-40和不可溶性Aβ1-40、可 溶 性Aβ1-42和 不 可 溶 性Aβ1-42試 劑 盒 中,然 后 加 入2,6-二乙基苯胺(DEA),以12 000 r/min 離心30 min后收集其上清液,以相應的酶聯免疫吸附法(ELISA)按照試劑盒說明書測定可溶性和不可溶性Aβ水平。

1.3.6 AQP4 表達水平的檢測 剪取小鼠的室周腦組織,勻漿、離心后提取其上清液。以總蛋白提取試劑盒來提取總蛋白,以考馬斯亮藍染液定量,加樣、電泳,轉膜120 min 后用TBST 洗膜3 次,每次10 min,加入AQP4 和GAPDH 的一抗,4 ℃孵育,過夜,二抗室溫下進行振蕩2 h。增強化學發光法(ECL)顯色,G:BOX chemiXR5 成像,Gel-Pro32 軟件分析圖像灰度值。AQP4/GAPDH 積分值為AQP4 蛋白相對表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0 進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行組間比較,最小顯著差異t檢驗(LSD-t)分析方法進行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 梓醇-川芎嗪方對APPswe/PS1dE9 雙轉基因小鼠行為學的作用

2.1.1 逃逸潛伏期 與對照組比較,模型組逃逸潛伏期明顯延長,差異有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較,CT-M 組、CT-H 組、安理申組逃逸潛伏期縮短,差異均有統計學意義(P＜0.05);在第5 天,CT-L組逃逸潛伏期縮短,差異有統計學意義(P＜0.05)。與CT-L 組比較,安理申組、CT-M 組、CT-H 組逃逸潛伏期縮短,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-M組比較,CT-H 組逃逸潛伏期縮短,差異有統計學意義(P＜0.05)。與安理申組比較,CT-H 組逃逸潛伏期縮短,差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠逃逸潛伏期比較(±s) 單位:s

表1 各組小鼠逃逸潛伏期比較(±s) 單位:s

模型組與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05;與CT-L 組比較,③P ＜0.05;與CT-M 組比較,④P ＜0.05;CT-H組與安理申組比較,⑤P ＜0.05。

組別 只數 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5 天對照組 10 35.14±3.26 26.42±3.44 21.45±3.82 17.44±2.71 12.11±1.22模型組 10 58.26±5.25① 49.21±4.36① 41.62±4.46① 36.52±3.82① 32.24±3.34①安理申組 10 46.47±4.34②③ 35.36±3.28②③ 30.23±3.39②③ 25.13±2.65②③ 20.32±2.51②③CT-L 組 10 55.32±5.56 43.44±4.67 36.28±3.47 30.26±2.43 26.28±2.43②CT-M 組 10 47.48±4.15②③ 34.12±3.58②③ 30.41±3.52②③ 24.28±2.26②③ 20.46±2.52②③CT-H 組 10 40.20±4.43②③④⑤ 28.24±3.77②③④⑤ 23.27±2.38②③④⑤ 20.16±2.37②③④⑤ 16.74±1.47②③④⑤

2.1.2 空間定位航行游泳距離 與對照組比較,模型組小鼠游泳距離明顯延長,差異有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較,安理申組、CT-M 組、CT-H 組游泳距離較模型組縮短,差異均有統計學意義(P＜0.05);第4 天、第5 天,CT-L 組游泳距離較模型組縮短,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-L 組比較,CT-M 組、CT-H 組、安理申組游泳距離縮短,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-M 組比較,CT-H組游泳距離縮短,差異有統計學意義(P＜0.05)。與安理申組比較,CT-H 組游泳距離縮短,差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠游泳距離比較(±s) 單位:cm

表2 各組小鼠游泳距離比較(±s) 單位:cm

模型組與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05;與CT-L 組比較,③P ＜0.05;與CT-M 組比較,④P ＜0.05;CT-H 組與安理申組比較,⑤P ＜0.05。

組別 只數 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5 天對照組 10 1 327.14±48.22 1 138.54±40.36 803.22±36.44 536.34±34.53 413.14±32.42模型組 10 1 613.26±53.34① 1 546.62±51.51① 1 388.40±48.35① 1 239.36±44.26① 1 135.12±41.33①安理申組 10 1 501.63±50.26②③ 1 378.71±48.67②③ 1 215.35±45.17②③ 956.52±42.37②③ 811.23±38.41②③CT-L 組 10 1 578.18±60.64 1 489.66±52.25 1 307.45±50.26 1 102.63±47.65② 1 003.52±43.29②CT-M 組 10 1 512.22±62.55②③ 1 382.53±46.74②③ 1 201.61±43.35②③ 969.73±40.74②③ 826.71±37.74②③CT-H 組 10 1 371.34±52.46②③④⑤ 1 205.11±42.76②③④⑤1 014.72±40.11②③④⑤ 802.44±38.83②③④⑤ 650.40±35.50②③④⑤

2.1.3 空間探索能力 與對照組比較,模型組TFAP明顯延長,NCP明顯減少,差異均有統計學意義(P＜0.05);與模型組比較,CT-M 組、CT-H 組、安理申組TFAP 縮短,NCP 增加,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-L 組比較,CT-M 組、CT-H 組、安理申組TFAP縮短,NCP增加,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-M 組比較,CT-H 組TFAP 縮短,NCP 增加,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與安理申組比較,CT-H 組TFAP 縮短,NCP 增加,差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠空間探索能力比較(±s )

表3 各組小鼠空間探索能力比較(±s )

模型組與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05;與CT-L 組比較,③P ＜0.05;與CT-M 組比較,④P ＜0.05;CT-H 組與安理申組比較,⑤P ＜0.05。

組別 只數 TFAP(s) NCP(次)對照組 10 7.16±1.02 5.24±0.71模型組 10 26.58±3.26① 1.28±0.13①安理申組 10 17.37±2.51②③ 3.08±0.24②③CT-L 組 10 23.28±3.71 1.89±0.15 CT-M 組 10 17.35±2.63②③ 3.10±0.26②③CT-H 組 10 11.04±1.97②③④⑤ 4.02±0.57②③④⑤

2.2 梓醇-川芎嗪方對APPswe/PS1dE9 雙轉基因小鼠腦內Aβ水平的影響 與對照組比較,模型組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平均明顯升高,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較,CT-M組、CT-H 組、安理申組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水 平 下 降,差 異 均 有 統 計 學 意 義(P＜0.05);CT-L 組小鼠腦內可溶性Aβ1-42水平較模型組下降,差異有統計學意義(P＜0.05)。與CT-L 組比較,安理申組、CT-M 組、CT-H 組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-M 組比較,CT-H 組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與安理申組比較,CT-H 組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見表4。

表4 各組小鼠腦內Aβ水平比較(±s) 單位:ng/mg

表4 各組小鼠腦內Aβ水平比較(±s) 單位:ng/mg

模型組與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05;與CT-L 組比較,③P ＜0.05;與CT-M 組比較,④P ＜0.05;CT-H 組與安理申組比較,⑤P ＜0.05。

組別 只數 可溶性Aβ1-40 不可溶性Aβ1-40 可溶性Aβ1-42 不可溶性Aβ1-42對照組 10 176.36±12.26 1.23±0.11 180.02±10.14 16.11±1.79模型組 10 433.25±18.33① 30.43±2.92① 756.47±20.25① 211.23±13.65①安理申組 10 327.41±16.46②③ 18.54±1.36②③ 603.62±16.37②③ 153.52±11.27②③CT-L 組 10 402.37±15.28 26.68±2.44 690.73±17.63② 197.61±10.24 CT-M 組 10 320.18±15.26②③ 17.71±1.40②③ 611.88±18.41②③ 149.43±8.16②③CT-H 組 10 295.22±13.31②③④⑤ 10.69±1.11②③④⑤ 532.64±14.60②③④⑤ 80.39±5.38②③④⑤

2.3 梓醇-川芎嗪方對APPswe/PS1dE9 雙轉基因小鼠SOD、MDA、CAT、T-AOC 水平的影響 與對照組比較,模型組小鼠海馬體和血清SOD、CAT 和T-AOC 水平均明顯下降,MDA 水平明顯升高,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較,安理申組、CT-M 組、CT-H 組小鼠海馬體和血清SOD、CAT 和T-AOC 水平升高,MDA 水平下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-L 組比較,安理申組、CT-M 組、CT-H 組小鼠海馬體和血清SOD、CAT 和T-AOC 水平升高,MDA 水平下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-M 組比較,CT-H 組小鼠海馬體和血清SOD、CAT和T-AOC 水平升高,MDA 水平下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與安理申組比較,CT-H 組小鼠海馬體和血清SOD、CAT 和T-AOC 水平升高,MDA 水平下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見表5、表6。

表5 各組小鼠海馬體中MDA、SOD、CAT、T-AOC 水平比較(±s )

表5 各組小鼠海馬體中MDA、SOD、CAT、T-AOC 水平比較(±s )

模型組與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05;與CT-L 組比較,③P ＜0.05;與CT-M 組比較,④P ＜0.05;CT-H 組與安理申組比較,⑤P ＜0.05。

組別 只數 SOD(U/mg) MDA(mmol/mg) CAT(U/mg) T-AOC(U/mg)對照組 10 368.37±17.28 2.06±0.12 0.38±0.03 0.31±0.03模型組 10 178.22±10.36① 24.34±2.54① 0.15±0.02① 0.05±0.00①安理申組 10 236.14±14.45②③ 15.12±1.13②③ 0.24±0.02②③ 0.13±0.01②③CT-L 組 10 165.26±11.37 21.26±2.43 0.16±0.01 0.06±0.00 CT-M 組 10 243.76±12.49②③ 15.41±1.22②③ 0.25±0.02②③ 0.12±0.01②③CT-H 組 10 352.84±16.33②③④⑤ 9.25±0.65②③④⑤ 0.35±0.03②③④⑤ 0.23±0.02②③④⑤

表6 各組小鼠血清SOD、MDA、CAT、T-AOC 水平比較(±s )

表6 各組小鼠血清SOD、MDA、CAT、T-AOC 水平比較(±s )

模型組與對照組比較,①P ＜0.05;與模型組比較,②P ＜0.05;與CT-L 組比較,③P ＜0.05;與CT-M 組比較,④P ＜0.05;CT-H 組與安理申組比較,⑤P ＜0.05。

組別 只數 SOD(U/mg) MDA(mmol/mg) CAT(U/mg) T-AOC(U/mg)對照組 10 410.26±17.28 5.27±0.17 40.22±3.88 1.12±0.03模型組 10 267.72±10.33① 23.36±2.06① 19.31±1.85① 0.43±0.01①安理申組 10 315.85±13.41②③ 14.42±1.12②③ 29.42±2.79②③ 0.71±0.03②③CT-L 組 10 280.45±10.52 21.28±2.08 21.27±2.63 0.46±0.02 CT-M 組 10 320.63±14.65②③ 13.45±1.16②③ 28.38±2.51②③ 0.72±0.03②③CT-H 組 10 383.54±16.47②③④⑤ 7.33±0.23②③④⑤ 37.42±3.22②③④⑤ 1.09±0.04②③④⑤

2.4 梓醇-川芎嗪方對APPswe/PS1dE9 雙轉基因小鼠室周腦組織AQP4 蛋白表達水平的影響 與對照組比較,模型組小鼠室周腦組織AQP4 蛋白表達水平明顯降低,差異有統計學意義(P＜0.05);與模型組比較,CT-M 組、CT-H 組小鼠室周腦組織AQP4 蛋白表達水平升高,差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠室周腦組織AQP4 蛋白表達條帶圖

圖2 各組室周腦組織AQP4 蛋白表達比較

3 討 論

中醫藥具有多途徑、多成分、多靶點、多通路、多層次作用的特點,且副作用小,對發病機制非常復雜的AD 的治療具有獨特的優勢。中藥有效組分是指中藥復方中具有相似化學性質或化學結構,對疾病具有治療作用的一類或多類有效成分群[9]。中藥有效組分配伍,不僅避免了傳統中藥方劑成分復雜等缺點,而且還保留了傳統方劑的特點和優勢[10]。

梓醇為玄參科植物地黃新鮮或干燥塊根中提取的小分子環烯醚萜類化合物[11],可以改善AD 大鼠大腦皮質結構異常,升高其大腦皮質膽堿能毒蕈堿受體M1亞型受體表達[12]。在血腦屏障的體外模型中,梓醇可以對Aβ1-42誘導的血腦屏障破壞具有保護作用[13]。川芎嗪為川芎的主要有效成分,可以下調AD 大鼠海馬神經元晚期糖基化終產物受體(RAGE)-細胞外信號調節激酶(ERK)1/2-p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)-核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路,從而有效抑制神經元活性氧生成,降低Aβ的神經毒性,改善AD 大鼠腦組織炎性,進而發揮其抗AD 作用[14]。

本研究結果表明,與模型組比較,CT-M 組、CT-H組、安理申組小鼠逃逸潛伏期、游泳距離、TFAP 均縮短,NCP 增加,差異均有統計學意義(P＜0.05);與CT-L 組比較,安理申組、CT-M 組、CT-H 組逃避潛伏期、游泳距離、TFAP 均縮短,NCP 增加,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-M 組比較,CT-H 組小鼠逃避潛伏期、游泳距離、TFAP 均縮短,NCP 增加,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與安理申組比較,CT-H 組小鼠逃避潛伏期、游泳距離、TFAP 均縮短,NCP 增加,差異均有統計學意義(P＜0.05)。這表明梓醇-川芎嗪方可以有效提高AD 模型小鼠的認知和記憶能力,其作用呈劑量依賴性,高劑量梓醇-川芎嗪方的效果優于安理申。本研究結果表明,與模型組比較,CT-M 組、CT-H 組、安理申組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平降低,海馬體和血清SOD、CAT 和T-AOC 水平升高,MDA水平下降,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-L 組比較,安理申組、CT-M 組、CT-H 組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平均降低,海馬體和血清SOD、CAT 和T-AOC 水平均升高,MDA水平降低,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與CT-M組比較,CT-H 組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平降低,海馬體和血清SOD、CAT 和T-AOC 水平升高,MDA水平降低,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與安理申組比較,CT-H 組小鼠腦內可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42水平降低,海馬體和血清SOD、CAT和T-AOC 水平升高,MDA 水平降低,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較,CT-M 組、CT-H 組小鼠室周腦組織AQP4 蛋白的表達水平升高,差異有統計學意義(P＜0.05)。

綜上所述,梓醇-川芎嗪方可以有效提高AD 模型小鼠的認知和記憶能力,作用優于安理申。其作用機制可能與降低AD 模型小鼠腦組織中Aβ沉積、調節氧化應激、上調AD 模型小鼠室周腦組織AQP4 蛋白表達水平有關。